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PhDstudent
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
 Inserito il - 20 marzo 2012 : 21:41:12
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Ciao a tutti,
scrivo con la speranza di riuscire a trovare soluzione ai miei problemi con il western blot :-) !
Ho analizzato 5 linee cellulari per rilevare la presenza di una determinata proteina tramite il western blot. La mia membrana è stata incubata con un anticorpo primario anti-proteina derivato dal coniglio e un anticorpo primario anti-tubulina derivato dal mouse (usata come loading control) ed infine ho usato due anticorpi secondari Cy3 e Cy5.
Alla fine del primo esperimento sono riuscita a rilevare le bande per la mia proteina. Dopo ho eseguito il knockdown della proteina e per ogni linea cellulare riesco solo ad ottenere solo le bande per la tubulina e non la mia proteina nel campione di controllo.
Quindi ho ripetuto l'esperimento iniziale e anche lì non riesco più ad avere bande. La cosa assurda è che il mio collega ha lo stesso identico problema ma lui lavora con un'altra proteina, perciò abbiamo pensato che fosse un problema con l'anticorpo secondario Cy5 ma lo stesso anticorpo funziona per gli esperimenti di un'altra collega.
Quale può essere il problema?
Grazie :-)
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2012 : 10:03:34
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scusa ma mi sfugge un particolare...
se tu fai knockdown della proteina allora è normale ke tu nn veda la banda in WB, mentre quelle del cntr (tubulina) si, xkè hai spento il gene di interesse.
magari mi è sfuggito qlcosa, ma letto così mi pare ke sia tutto normale... |
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PhDstudent
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2012 : 10:38:38
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intendo dire che non ho la banda per il campione non trattato con i siRNA (il quale uso come controllo per la mia proteina mentre la tubulina e' il loading control).
Nel primo esperimento ho analizzato la proteina nelle cellule senza knockdown e ho avuto le bande.
Poi ho fatto il knockdown tenendo perö un campione non trattato e da allora non ho piü bande per la mia proteina. Ho anche ripetuto il primo esperimento in cui avevo ottenuto le bande, usando lo stesso lisato ma anche in questo caso non ho piü bande per la proteina ricercata ma solo per la tubulina.
Spero di essere stata un pö piü chiara questa volta.
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2012 : 10:42:46
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Domanda banalissima: il Cy5 che usa la vostra collega è proprio lo stesso che usate voi? O è un lotto diverso/conservato diversamente ecc..?
Hai cambiato qualcosa nelle condizioni del Western da un esperimento all'altro? |
“Research is what I'm doing when I don't know what I'm doing”Werner von Braun |
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PhDstudent
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2012 : 10:54:51
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il Cy5 e lo stesso presso esattamente dallo stesso box.
Non ho cambiato nulla e per questo non riesco a trovare una spiegazione logica. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:02:47
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La vostra collega vi sta sabotando 
Facile
Scherzo, sono un novizio dei WB ma se mi viene in mente un'idea, posto |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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PhDstudent
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:09:14
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mmm i tedeschi non fanno queste cose ahahaha !!
cmq adesso provo ad incubare la membrana con un altro anticorpo secondario!! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:11:05
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Ehehe
Per rilevare le bande di tubulina usi lo stesso secondario? |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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PhDstudent
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:16:10
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| no uso Cy3 anti-mouse |
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:17:04
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| E se il problema fosse il primario..? |
“Research is what I'm doing when I don't know what I'm doing”Werner von Braun |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:28:57
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| Scrive che un suo collega studia un'altra proteina ed ha lo stesso problema. Poi magari i due ab1 sono conservati assieme e male... |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:41:31
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| In effetti è vero, le due proteine sono diverse... Però se il Cy5 alla collega funziona non sembrerebbe un problema di secondario... Oppure è vero che li sta sabotando! |
“Research is what I'm doing when I don't know what I'm doing”Werner von Braun |
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Western blot
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