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PhDstudent
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11 Messaggi

Inserito il - 20 marzo 2012 : 21:41:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di PhDstudent Invia a PhDstudent un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,

scrivo con la speranza di riuscire a trovare soluzione ai miei problemi con il western blot :-) !

Ho analizzato 5 linee cellulari per rilevare la presenza di una determinata proteina tramite il western blot. La mia membrana è stata incubata con un anticorpo primario anti-proteina derivato dal coniglio e un anticorpo primario anti-tubulina derivato dal mouse (usata come loading control) ed infine ho usato due anticorpi secondari Cy3 e Cy5.
Alla fine del primo esperimento sono riuscita a rilevare le bande per la mia proteina. Dopo ho eseguito il knockdown della proteina e per ogni linea cellulare riesco solo ad ottenere solo le bande per la tubulina e non la mia proteina nel campione di controllo.
Quindi ho ripetuto l'esperimento iniziale e anche lì non riesco più ad avere bande. La cosa assurda è che il mio collega ha lo stesso identico problema ma lui lavora con un'altra proteina, perciò abbiamo pensato che fosse un problema con l'anticorpo secondario Cy5 ma lo stesso anticorpo funziona per gli esperimenti di un'altra collega.
Quale può essere il problema?

Grazie :-)

Daria85
Utente

aplisia



678 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2012 : 10:03:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Daria85 Invia a Daria85 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
scusa ma mi sfugge un particolare...
se tu fai knockdown della proteina allora è normale ke tu nn veda la banda in WB, mentre quelle del cntr (tubulina) si, xkè hai spento il gene di interesse.

magari mi è sfuggito qlcosa, ma letto così mi pare ke sia tutto normale...
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PhDstudent
Nuovo Arrivato



11 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2012 : 10:38:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di PhDstudent Invia a PhDstudent un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
intendo dire che non ho la banda per il campione non trattato con i siRNA (il quale uso come controllo per la mia proteina mentre la tubulina e' il loading control).
Nel primo esperimento ho analizzato la proteina nelle cellule senza knockdown e ho avuto le bande.
Poi ho fatto il knockdown tenendo perö un campione non trattato e da allora non ho piü bande per la mia proteina. Ho anche ripetuto il primo esperimento in cui avevo ottenuto le bande, usando lo stesso lisato ma anche in questo caso non ho piü bande per la proteina ricercata ma solo per la tubulina.

Spero di essere stata un pö piü chiara questa volta.
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cami
Utente Junior

p

Città: roma


136 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2012 : 10:42:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cami Invia a cami un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Domanda banalissima: il Cy5 che usa la vostra collega è proprio lo stesso che usate voi? O è un lotto diverso/conservato diversamente ecc..?
Hai cambiato qualcosa nelle condizioni del Western da un esperimento all'altro?

“Research is what I'm doing when I don't know what I'm doing”
Werner von Braun
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PhDstudent
Nuovo Arrivato



11 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2012 : 10:54:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di PhDstudent Invia a PhDstudent un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
il Cy5 e lo stesso presso esattamente dallo stesso box.
Non ho cambiato nulla e per questo non riesco a trovare una spiegazione logica.
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3825 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:02:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La vostra collega vi sta sabotando
Facile





Scherzo, sono un novizio dei WB ma se mi viene in mente un'idea, posto

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PhDstudent
Nuovo Arrivato



11 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:09:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di PhDstudent Invia a PhDstudent un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mmm i tedeschi non fanno queste cose ahahaha !!

cmq adesso provo ad incubare la membrana con un altro anticorpo secondario!!
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3825 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:11:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ehehe


Per rilevare le bande di tubulina usi lo stesso secondario?

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PhDstudent
Nuovo Arrivato



11 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:16:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di PhDstudent Invia a PhDstudent un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
no uso Cy3 anti-mouse
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cami
Utente Junior

p

Città: roma


136 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:17:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cami Invia a cami un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
E se il problema fosse il primario..?

“Research is what I'm doing when I don't know what I'm doing”
Werner von Braun
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3825 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:28:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scrive che un suo collega studia un'altra proteina ed ha lo stesso problema. Poi magari i due ab1 sono conservati assieme e male...

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cami
Utente Junior

p

Città: roma


136 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2012 : 11:41:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cami Invia a cami un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In effetti è vero, le due proteine sono diverse... Però se il Cy5 alla collega funziona non sembrerebbe un problema di secondario... Oppure è vero che li sta sabotando!

“Research is what I'm doing when I don't know what I'm doing”
Werner von Braun
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