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kikkapais
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 Inserito il - 21 maggio 2012 : 19:21:13
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Ciao a tutti! Chiedo il vostro aiuto per un problema che mi sta facendo diventare matta!
In laboratorio sto cercando di sequenziare una regione variabile del gene K1 dell'HHV8 in pazienti diabetici DM2, che, non presentando nessun tipo di sintomo, ovviamente hanno una carica virale molto bassa.
Per ovviare questo problema, dopo l'isolamento, metto in coltura i linfociti dei pazienti, li attivo con interleuchina e successivamente con TPA, che, qualora il virus sia presente, dovrebbe,attivarne l'espressione da parte delle cellule nelle quali è presente in forma latente.
Seguono estrazione del DNA e Nested PCR. Con i primers esterni ottengo un amplificato di circa 900 pb,proprio quello atteso. Con i primers interni invece, che dovrebbero amplificare una zona di circa 400 pb, ottengo un amplificato di quasi 700 pb!! e la cosa strana è che, facendo una touch down pcr, ottengo un bellissimo prodotto puro!
Per curiosità proverò comunque a sequenziare quelle bande, ma secondo voi qual è la ragione di questa differenza?? E' possibile che i linfociti dei pazienti diabetici, che peraltro ricordo, non presentano sintomi, abbiano in forma episomale un virus che nella regione che vado a studiare presenta addirittura una sequenza più lunga??
Ve lo chiedo perchè è da poco che mi occupo di sequenziamento, sono proprio alle prime armi
Grazie mille a chi avrà la pazienza di leggere questo monologo!! 
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