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BioVE88
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 25 maggio 2012 : 11:47:36
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Ciao a tutti,
sono nuovo di questo forum e subito pongo un quesito sperando di trovare una risposta!!
Devo verificare la funzionalità di alcuni Enzimi di Restrizione che poi mi serviranno per verificare della variazioni su un gene ma non riesco a farli funzionare :( Sono della NewEngland Biolabs. qualcuno li ha già usati e mi può dare qualche consiglio sul protocollo??
GRAZIEEEEEEEEE
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valestellina
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
 Inserito il - 25 maggio 2012 : 12:11:24
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I biolabs sono i più usati, quindi credo molti lo abbiano fatto.
La mia domanda è: di che enzimi si tratta?
Il suggerimento di base è di prendere il data sheet di ogni enzima e verificare in quale buffer funziona (ci sono 4 tipi di buffer che la biolabs fornisce o in ogni caso ci sono le ricette e te li puoi fare anche in casa), se è necessaria l'aggiunta di BSA, qual'è il sito di taglio (blunt, sticky, la sequenza...), etc...
La maggior parte degli enzimi compie la sua reazione in 3h a 37°C, ma alcuni necessitano di più tempo in base a quando DNA devi digerire, la qualità dell'enzima...etc...attenzione però che di solito dopo un lungo periodo (tipicamente una O/N) molti enzimi danno attività aspecifica.
In ogni caso sul sito della biolabs danno tutte le info necessarie per ogni enzima.
http://www.neb.com/nebecomm/products/category1.asp
Dopo che hai verificato questo dato, la prova più semplice che puoi fare è prendere del DNA (anche non quello su cui poi andrai a fare la prova) e fare delle digestioni analitiche: pochi ug di DNA in 50 ul finali di reazione tipicamente sono sufficienti per del DNA plasmidico. La scelta del DNA su cui fare le prove ovviamente la dovresti fare facendo una mappa di restrizione sulla sequenza (ci sono molti software online come ad esempio sequence manipulation suite http://www.bioinformatics.org/sms2/)e vedere quanti siti di taglio per quell'enzima e che bande ti devi aspettare dopo la digestione (numero e lunghezza).
Fai la prova, carichi un gel di agarosio (usando come riferimento il non digerito) e vedi se gli enzimi funzionano oppure no. |
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BioVE88
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 26 maggio 2012 : 10:44:27
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Gli enzimi sono due: BseRI e MnlI
Ho letto i data sheet e già verificato anche dove sono i siti di taglio e quanti frammenti si formano in un programma online. ho letto in che buffer e uno dei due enzimi è consigliabile usarlo con il BSA per migliorare la reazione ma non riesco ad uscirne con le quantitàù. ti dico il prodotto di dna è da PCR e non plasmidico!!!!
mi potresti dare qualche altra dritta??
cmq grazie mille della risposta è stata molto esauriente e interessante!!!! |
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