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sagraman
Nuovo Arrivato



18 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2012 : 11:28:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di sagraman Invia a sagraman un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sto leggendo un articolo riguardante la produzione di alcune proteine ricombinanti attraverso l utilizzo di particolari vettori. Questa è una porzione di articolo:

To generate pCMV-Myc-eIF4E, which encodes MYc-tagged full-lenght human eIF4E, a Klenow filled NotI fragment of pCMV-Myc was ligated to a Klenow filled-BamHI/HindIII fragment of pcDNA3-FLAG-eIF4E

Ora vorrei porre qualche domanda:
1 suppongo che "klenow filled notI" significhi che il vettore sia stato tagliato con NotI e riempito col frammento di Klenow....ma riempito con cosa??
2 per quale motivo è stato necessario unire due vettori di espressione??non potevamo inserire direttamente in gene per eIF4E in un vettore di espressione??

Grazie

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2012 : 11:58:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Gli enzimi di restrizione utilizzati lasciano dei frammenti sticky, per renderli blunt si utilizza un "fill in" con il frammento di Klenow.
Detto in parole povere (anzi con i disegnini)
hai una cosa così:
-----------------------
   -----------------------

e dopo "fill in" diventa così:
--------------------------
--------------------------


Semplicemente avevano già clonato il gene eIF4E all'interno di un vettore (pcDNA3-FLAG-eIF4E) e l'hanno semplicemente trasferito nel nuovo vettore con il nuovo tag myc (pCMV-Myc) formando il vettore finale pCMV-Myc-eIF4E.
Non hanno "fuso" i due vettori, hanno solo tolto il gene da uno per metterlo nell'altro.
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2012 : 12:02:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non credo siano stati uniti due vettori di espressione.
Piuttosto la sequenza codificante eIF4E era prima inserita all'interno del pCDNA3-FLAG, di modo da amplificarne il numero di copie, e poi è stata rimossa dal vettore tagliando al 5' e 3' con BamHI e HindIII.

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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sagraman
Nuovo Arrivato



18 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2012 : 12:04:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di sagraman Invia a sagraman un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille!!!
Più semplice di quello che pensavo
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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2012 : 12:57:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
1) Il Klenow-fill in sfrutta l'attività polimerasica 3'-5' del frammento di Klenow per rendere "blunt" le estremità "sticky". Ovviamente il "riempimento" si riferisce ai dNTP, che vengono aggiunti alla reazione.

2)Ma se si vuole costruire una proteina di fusione, devo partire da due geni, non trovi? Ed è quello che hanno fatto: prendere il frammento contenente il gene y dal plasmide B e inserirlo nel plasmide A che contiene il gene x.
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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2012 : 13:00:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok, sorry... il mio mess è stato pubblicato con un'ora di ritardo! :)
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2012 : 13:54:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cioè tu hai inviato il messaggio alle 12 e questo è comparso alle 13?

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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2012 : 14:07:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ho scritto il messaggio, lasciato il computer per andare ad una riunione e appena tornata l'ho inviato senza notare che c'erano già delle risposte... tra l'altro una bella riunione, di quelle che ti fanno capire quanto nel lavoro contino molto di più la politica e le tue connessioni umane che altro. anche nella ricerca, si', dove scambiarsi pareri e protocolli dovrebbe essere normale. davvero inaccettabile.

scusa l'OT, mi sono fatta prendere la mano. Spero comunque che l'utente abbia chiarito i suoi dubbi.
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2012 : 21:09:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
l'attività polimerasica è 5'->3'. 3'->5' è la direzione dell'attività esonucleasica (che però nella Klenow non è così efficiente come nella T4 pol)

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