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Dalila909
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
 Inserito il - 27 giugno 2012 : 10:25:46
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Salve, vorrei dei chiarimenti riguardo il meccanismo del sequenziamento mediante shotgun e clone by clone.
Con il metodo shotgun andiamo a sequenziare genomi abbastanza piccoli, prima di tutto frammentiamo il nostro genoma attraverso sonicazione. Amplifichiamo i frammenti tramite vettori ottenendo dei clusters di sequenze identiche per ogni nostro frammento (libreria genomica). Ogni frammento della libreria genomica può essere ora sequenziato a partire dall'una o l'altra estremità dell'inserto, quindi otteniamo le reads (forward o reverse).
Ora dobbiamo assemblare queste reads in contigs cercando delle sovrapposizioni overlap...ed ecco la prima cosa che non mi è molto chiara...se ho delle piccole sequenze di DNA sequenziate in entrambe le direzioni quando trovo le sovrapposizioni devo tenere conto in quale direzione sono le reads e in base a ciò come faccio a dire che due reads sono consecutive?.
Dopo l'assemblaggio ho la fase di finishing in cui devo manualmente rivedere i dati dell'assemblaggio e correggere eventuali errori. Invece la chiusura dei gap come si ottiene???.
Lo shotgun colone by clone si utilizza per genomi di grandi dimensioni e consiste nel creare una mappa fisica per poi applicare il metodo shotgun.
Ma la mappa la faccio dopo aver creato la libreria di cloni giusto?
e che significa quando si dice che sequenziamo le estremità dei vettori BAC per avere informazioni posizionali?
Ho le idee un pò confuse qualcuno può aiutarmi??
Anche se avete a disposizione delle dispense o dei video, sto studiando dal libro di bioinformatica Valle ma alcune precisazioni giustamente vengono omesse.
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Dalila909
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2012 : 11:38:34
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| Figurati, il fatto è che mi servirebbe una risposta minuziosa riguardo queste tecniche |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2012 : 11:54:07
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Hai già provato a cercare qualcosa sul forum?
Ricordo che avevo posto una domanda analoga alla tua un annetto fa, e non ricevetti risposta.
Se la trovo te la linko, almeno vedi se ti ritrovi con quello che sapevo io all'epoca 
edit. ecco http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=22975&SearchTerms=shotgun
Comunque ci sono anche altre discussioni che puoi leggere. |
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Dalila909
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2012 : 12:35:58
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Si avevo già letto la tua discussione ma leggendo altri documenti non mi trovo ad esempio la libreria di cloni lunghi (ottenuto tramite sonicazione) da quanto ho capito viene creata per ottenere una mappa fisica sequenziando solo le loro estremità; parallelamente quei frammenti lunghi vengono saparati mediante gel di agarosio per selezionare frammenti di 1,5 2 Kb che vengono poi amplificati, viene creata un'altra libreria di cloni e questi vengono sequenziati.
Si ottiene un elettroferogramma analizzato con Phred ed abbiamo le reads che tramite un programma Phrap vengono assemblate in contigs.
Il mio problema è ...per i procarioti si fa questa cosa di sequenziare le estremità dei frammenti lunghi? quando si utilizza una mappa di restrizione e quando una mappa genetica? E soprattuto come si chiudono i gap? |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2012 : 12:40:28
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| Purtroppo ai fini del corso non siamo entrati nei particolari tecnici dell'argomento, quindi non saprei aiutarti.. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2012 : 13:53:34
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Per favore niente cross-posting!
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Discussione |
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Sequenziamento shotgun e clone by clone
Didattica
