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jovy
Nuovo Arrivato



102 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2012 : 13:10:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jovy Invia a jovy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sto facendo espressione di proteine di fusione alla GST (con plasmide della famiglia pGEX). Ho corso su SDS-PAGE le proteine dopo purificazione e in qualche campione è visibile, oltre alla banda corrisponedente alla mia proteina, una banda di altezza pari a quella della proteina wt. E' possibile che questa sia la GST endogena del ceppo che uso per l'espressione?
Grazie in anticipo.

gi

0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2012 : 15:48:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao, ci lavoro con proteine in fusione con GST espresse in pGEX, ma non capisco cosa intendi...
Io mi aspetterei di vedere, dopo purificazione su glutathion Sepharose columns, una banda di peso molecolare apparente pari al peso molecolare della proteina + peso molecolare di GST (circa 30 kDa).
Posso poi avere bande a pesi molecolari apperenti minori, dovuti ad un'eventuale degradazione della proteina di fusione, che potrebbe non foldarsi a dovere.
Se non sai con cos'hai a che fare, puoi trasferire su membrana e operare un immunoblot usando un anticorpo antiGST

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2012 : 15:59:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
E' possibile che la tua proteina formi omodimeri? (o omo-multimeri)

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jovy
Nuovo Arrivato



102 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:04:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jovy Invia a jovy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie per le risposte!
Vedo sia una banda di circa 27KDa (GST wt) che una più alta (GST-peptide).
La proteina non dovrebbe formare multimeri...0barra1 confermi?

gi
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1043 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:05:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
I batteri comunque sono dotati di una propria GST, ma non so se, portandotela dietro nella purificazione, possa dare vita a una banda tanto evidente da attirare la tua attenzione...
Comunque una leggere differenza di PM tra la GST batterica e quella inclusa nei vettori pGEX (che deriva dallo schistosoma se non sbaglio) c'è, ma sarà dura distinguerle in un gel.


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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:10:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da jovy

Grazie per le risposte!
Vedo sia una banda di circa 27KDa (GST wt) che una più alta (GST-peptide).
La proteina non dovrebbe formare multimeri...0barra1 confermi?


pardon, forse non ho capito io: ti ritrovi una banda in più, corrispondente alla GST (sui 26 KDa)?

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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:10:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho avuto questo tipo di profilo elettroforetico. In alcuni casi ho dovuto purificare la GST-protein dai frammenti di degradazione in size-exclusion chromatography. Ma tra frammenti e full-length dev'esserci una certa disparità di dimensioni, altrimenti c'è poco da fare.

Teoricamente non dovresti vedere multimeri per via delle condizioni denaturanti in cui corri il gel, a prescindere dalle proprietà della proteina wt.

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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:19:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1


Teoricamente non dovresti vedere multimeri per via delle condizioni denaturanti in cui corri il gel, a prescindere dalle proprietà della proteina wt.




Se la proteina forma multimeri con copie non taggate e presenti nel sistema di espressione (in questo caso batterio), poi te le ritrovi anche nell'elettroforesi.
Ma visto che il peso molecolare è quello della GST, e visto che dubito che stia esprimendo una proteina batterica, potrebbe effettivamente trattarsi di GST endogena come suggerito da Geeko.


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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:20:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Trattandosi di una SDS-PAGE mi sembra difficile, anche se non impossibile, la presenza di multimeri

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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2012 : 16:38:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
"RSV P* recombinant protein
forms oligomers
To determine whether the RSV P protein expressed in E. coli
was able to form oligomers, we co-expressed GST-P and
His-P in bacteria by using a double antibiotics selection
protocol. The ampicillin+kanamycin-resistant colonies
were amplified in LB containing both antibiotics, and
expression of proteins was induced with IPTG. After
purification of GST-P with glutathione–Sepharose beads,
the purified proteins were analysed by SDS-PAGE. As
shown in Fig. 4(A), two polypeptides were co-purified by
glutathione–Sepharose affinity, with apparent masses of
±50 and ±40 kDa, as expected for GST-P and His-P,
respectively. The identity of GST-P and His-P was
determined by mass spectrometry and N-terminal sequencing.
This experiment showed that the unphosphorylated
form of RSV P protein formed stable oligomers in
bacteria."


Tratto da:
Castagné et al., Journal of General Virology (2004).


Ma nel caso proposto dall'utente, credo effettivamente possa trattarsi di GST endogena, o "whhatever"...


P.S.: 0/1 non vedo la tua firma.

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