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 Vettore shuttle in lievito
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lor89
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Inserito il - 12 luglio 2012 : 01:54:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lor89 Invia a lor89 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
salve ragazzi mi potreste spiegare come funziona e perché uso un vettore shuttle che ha una conponente derivante dal lievito e una di E.coli con i vari promotori e sopratutto il gene del lievito (leu2) a cosa serve? a cosa mi serve inserire un cdna derivante da una library di E.coli in un vettore shuttle per esempio un cDna codificante per la proteina S per il vaccino delle epatite B? grazie

lor89
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 12 luglio 2012 : 12:31:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lor89 Invia a lor89 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
help!! nessuno lo sa? mi basterebbe un esempio su un vettore shuttle per capire, grazie.
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 14 luglio 2012 : 11:11:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si chiama shuttle perchè per usarlo sei in un certo senso "obbligato" a passare da e.coli, questo perchè sono vettori in genere a basso numero di copie vale a dire da 1-2 circa a 20-50 per cellula di lievito, ovviamente dipende dall'origine di replicazione.
In questo caso che è una ars



quindi come tu saprai le ars sono sequenze di replicazione cromosomiche ed il plasmide si replicherà solo in fase S.

In questo caso invece



ha l'origine di replicazione 2u che e' un'origine di replicazione che deriva dall'episoma del lievito ed ha un numero di copie piu' elevato.

ovviamente, visto il numero basso di costrutti nelle cellule di lievito, come in tutti i tipi di trasfezione/trasformazione i plasmidi contengono anche l'origine di replicazione dei batteri che ne producono un gran numero di copie per poi estrarli e trasformarli in questo caso in lievito.

Come potrai notare i vettori hanno un marcatore di selezione che in questo caso è URA3, ma ce ne sono diversi di marcatori biochimici di selezione come His (il tuo Leu2) Trp etc... e ti serve appunto per far si che il lievito mantenga il plasmide in quanto è mutante per quel gene.
Ad esempio se io uno un plasmide Leu2 il lievito che usero' sarà Leu2 minus, cioe' knock out per Leu2 quindi per vivere ha bisogno di quel gene.

I lieviti possono essere usati per l'espressione di una proteina eterologa come anche i batteri, ma il vantaggio dei lieviti è che fanno splicing ed capaci di modificazione post traduzionale quindi immagino che il caso del vaccino rientri in una di queste 2.
Spero di esserti stato d'aiuto
buona notte




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lor89
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 14 luglio 2012 : 12:38:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lor89 Invia a lor89 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie patrizio per la risposta molto esaustiva ti espongo qui i miei dubbi: quindi ricapitolando uso il vettore shuttle in quanto mi permette di avere un alto numero di copie per es in e.coli a differenza di quanto avrei in una cellula di lievito, per i marcatori biochimici il fatto dovrebbe essere che se ho un gene mutato nel lievito (quindi penso non ci sia più replicazione in quanto è mutato un gene del genoma del lievito)devo inserire un plasmide nel lievito contenente appunto un marcatore biochimico per far si che il lievito cresca.
p.s ma le origini di replicazioni regolano diciamo il numero di plasmidi quindi la replicaizone all'interno di un organismo no?!? possiamo dire quindi ho un origine di relicazione più forte di un'altra?

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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 14 luglio 2012 : 20:25:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da lor89

per i marcatori biochimici il fatto dovrebbe essere che se ho un gene mutato nel lievito (quindi penso non ci sia più replicazione in quanto è mutato un gene del genoma del lievito)devo inserire un plasmide nel lievito contenente appunto un marcatore biochimico per far si che il lievito cresca.



Devi per forza usare un lievito che sia mutato per il marcatore che scegli altrimenti il lievito non avrebbe motivo di mantenere il plasmide al suo interno ...lo butterebbe via :) , ovviamente lo farai crescere un un terreno drop out per quel determinato amminoacido in modo che cresceranno solo i liviti contenente il plasmide.

Citazione:

p.s ma le origini di replicazioni regolano diciamo il numero di plasmidi quindi la replicaizone all'interno di un organismo no?!? possiamo dire quindi ho un origine di relicazione più forte di un'altra?


non so se ho capito bene, le ORI permettono la duplicazione genomica o episomica nel caso di 2micro ma questo non dipende principalmente da loro ma da un vasto pathway che regola la divisione cellulare.
Infine, si potresti dire che una ORI è piu' forte di un'altra


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lor89
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 15 luglio 2012 : 11:48:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lor89 Invia a lor89 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si ci siamo ho capito! patrizio grazie delle tue risposte, mi hai levato veramente tutti i dubbi :)
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