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 Clonaggio in vettori e PCR, quando l'una e quando l'altra?
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Dr Lopez
Utente Junior

Phil


141 Messaggi

Inserito il - 12 luglio 2012 : 10:50:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dr Lopez Invia a Dr Lopez un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per mezzo della PCR e del clonaggio in vettori riesco ad amplificare un tratto di DNA. Mi pare di aver capito anche che per quanto riguarda la PCR non posso parlare di clonaggio, in quanto non assistiamo alla formazione di nuovi organismi geneticamente uguali, come invece avviene in seguito alla divisione cellulare dei batteri che hanno ricevuto il vettore contenente l'inserto. Quello che non riesco a comprendere Ŕ in quali casi mi conviene utilizzare il clonaggio e in quali Ŕ meglio usare la PCR... E' per caso una questione di grandezza del frammento che mi interessa amplificare?? Grazie a tutti per l'attenzione...


Utente Junior



565 Messaggi

Inserito il - 12 luglio 2012 : 11:03:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lÓ Invia a lÓ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
dunque, clonaggio e pcr sono due cose molto diverse

1) per "clonaggio" si intende l'inserzione di un tratto di DNA (un gene) in un vettore che possa esprimere la proteina che corrisponde a quel gene in una cellula

2) la PCR ti serve per amplificare il tratto di DNA relativo a quel gene, oppure per inserire dei siti di restrizione che ti serviranno per inserire il gene nel vettore di espressione che tu hai scelto precedentemente
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roberta.s
Utente Junior

yeast

CittÓ: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 12 luglio 2012 : 11:12:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non so se ho ben capito il tuo dubbio. Ti rispondo per cio' che ho inteso, ma se ho capito tutta un'altra cosa fammelo presente!

Riguardo la definizione di clonaggio molecolare, riporto da wikipedia, che cita J. Watson:
Molecular cloning is a set of experimental methods in molecular biology that are used to assemble recombinant DNA molecules and to direct their replication within host organisms.

La PCR altro non Ŕ che uno step facente parte del clonaggio. Se vuoi clonare un gene in un vettore, devi prima amplificare il gene dal DNA genomico, a meno che tu non disponga di un secondo vettore contenente il gene che ti interessa. In tal caso puoi effettuare un sub-clonaggio, senza ricorrere alla PCR: digestione enzimatica del vettore contenente il gene e reintegrazione del gene nel vettore finale tramite ligation.
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Dr Lopez
Utente Junior

Phil



141 Messaggi

Inserito il - 12 luglio 2012 : 11:31:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dr Lopez Invia a Dr Lopez un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Innanzitutto ringrazio entrambi per le risposte. Tuttavia il mio dubbio non Ŕ ancora stato chiarito, probabilmente perchŔ non mi sono ben spiegato,
Per spiegarmi meglio faccio un esempio. Il professore a lezione ci aveva spiegato che se desidero ad esempio studiare le giunzioni esoni-introni all'interno di un gene, mi conviene fare PCR del cDNA ottenuto dalla retrotrascrizione dell'mRNA processato (quindi privo di introni) e fare PCR del DNA di partenza (quindi con introni). In questo modo ognuna delle due PCR mi darÓ vita a frammenti di lunghezza differente, e confrontandoli, potr˛ facilmente studiare le giunzioni esoni-introni. Ecco, a tal proposito, mi domando per quale motivo non potevo pensare di amplificare sia il DNA di partenza che il cDNA ottenuto dalla retrotrascrizione dell'mRNA inserendoli in vettori e successivamente in batteri, che riproducendosi avrebbero dato vita a pi¨ copie dei due tipi di DNA che voglio studiare... CioŔ capisco che il secondo metodo sarebbe stato molto pi¨ laborioso e lungo, ma la motivazione per la quale scelgo la PCR Ŕ solo questa????
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Dr Lopez
Utente Junior

Phil



141 Messaggi

Inserito il - 12 luglio 2012 : 11:48:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dr Lopez Invia a Dr Lopez un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Aggiungo anche la domanda inversa... Nel sequenziamento shotgun gerarchico, dopo aver frammentato il DNA di partenza in grandi inserti, li vado ad inserire in vettori BAC o PAC e amplifico... Non potevo semplicemente fare PCR???
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roberta.s
Utente Junior

yeast

CittÓ: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 12 luglio 2012 : 14:27:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Dr Lopez

Il professore a lezione ci aveva spiegato che se desidero ad esempio studiare le giunzioni esoni-introni all'interno di un gene, mi conviene fare PCR del cDNA ottenuto dalla retrotrascrizione dell'mRNA processato (quindi privo di introni) e fare PCR del DNA di partenza (quindi con introni). In questo modo ognuna delle due PCR mi darÓ vita a frammenti di lunghezza differente, e confrontandoli, potr˛ facilmente studiare le giunzioni esoni-introni. Ecco, a tal proposito, mi domando per quale motivo non potevo pensare di amplificare sia il DNA di partenza che il cDNA ottenuto dalla retrotrascrizione dell'mRNA inserendoli in vettori e successivamente in batteri, che riproducendosi avrebbero dato vita a pi¨ copie dei due tipi di DNA che voglio studiare... CioŔ capisco che il secondo metodo sarebbe stato molto pi¨ laborioso e lungo, ma la motivazione per la quale scelgo la PCR Ŕ solo questa????


In questo caso lo scopo dell'esperimento Ŕ fare una valutazione di un gene all'interno di un dato organismo. Non Ŕ necessario clonare il gene (che, come dici, Ŕ un processo lungo, laborioso e dispendioso!), perchŔ puoi ottenere la risposta che cerchi con una semplicissima PCR!
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roberta.s
Utente Junior

yeast

CittÓ: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 12 luglio 2012 : 14:34:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Dr Lopez

Aggiungo anche la domanda inversa... Nel sequenziamento shotgun gerarchico, dopo aver frammentato il DNA di partenza in grandi inserti, li vado ad inserire in vettori BAC o PAC e amplifico... Non potevo semplicemente fare PCR???


Dovresti fare PCR singole su tutto il genoma! Puoi sequenziare in questo modo quando ti interessa una breve sequenza (considera che ogni PCR deve essere amplificare non pi¨ di 1 kb, dipende dalla piattaforma di sequenziamento del posto in cui ti trovi), ma per sequenziare l'intero genoma devi prima costruire una libreria del suddetto genoma e poi inviarla per il sequenziamento.
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Dr Lopez
Utente Junior

Phil



141 Messaggi

Inserito il - 12 luglio 2012 : 14:37:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dr Lopez Invia a Dr Lopez un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok chiaro, grazie mille :)
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