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Lucia
Nuovo Arrivato


Prov.: Caserta
Città: Caserta


19 Messaggi

Inserito il - 14 gennaio 2007 : 16:32:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Lucia Invia a Lucia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, sto avendo dei problemi con la colorazione argentica dei gel 2D di proteine:
Il protocollo che uso è il seguente:
SILVER STAINING
SOLUZIONI
FIXING SOLUTION 40% Etanolo; 10% Acido Acetico.
WASHING SOLUTION I 30% Etanolo.
WASHING SOLUTION II 20% Etanolo.
SENSITIZER SOLUTION 0,02% Na2S2O3
SILVER SATIN 0,02% AgNO3 (Aggiungere 0,02% di formaldeide prima dell’uso).
SOLUZIONE DI SVILUPPO 3% Na2CO3 (Aggiungere 0,05% di formaldeide prima dell’uso).
BLOCKING SOLUTION 0,5% Glicina.

PROCEDIMENTO
1.Incubare il gel nella fixing solution da 3h a 3 giorni;
2.Lavare 20’ nella Washing Solution I;
3.Lavare 20’ nella Washing Solution II;
4.Lavare 20’ in H2Omq;
5.Incubare il gel 1’ in Sensitizer solution;
6.Lavare 20’’ in H2Omq (x3);
7.Colorare per 20’ con il Silver Stain;
8.Lavare 20’’ in H2Omq (x3);
9.Incubare 3-5’ nella Soluzione di Sviluppo;
10.Lavare 20’’ con H2Odemi;
11.Incubare 5’ nella Blocking Solution;
12.Lavare 10’ in H2Odemi (x3);
Inizialmente rispettando i tempi riportati nel protocollo, il gel si colorava come previsto, adesso, invece, i 3-5 minuti di sviluppo non bastano e per far comparire i primi spot, delle volte, devo aspettare anche 15 minuti. Qualcuno mi sa dire PERCHE’?

Il problema sembra essere legato esclusivamente al colorante dal momento che ho provato a colorare un gel con su caricati 4microl di Standard/marker che ha impiegato più tempo delle altre volte a colorarsi ed è apparso molto meno colorato rispetto alle prime volte.
Di seguito vi scrivo delle informazioni che, credo, vi potranno essere utili:
- ho preparato 2 volte le soluzioni ex novo, credendo che in qualche modo potressero essere state preparate male;
- ho conservato la soluzione Silver satin a 4°C in una bottiglia trasparente (ma questo da sempre);
- ho utilizzato più volte la stessa vaschetta per i lavaggi, colorazione e sviluppo (è possibile che la vaschetta abbia assorbito che so… la blocking solution?);
- le quantità che sto caricando sul gel sono il doppio rispetto a quelle che caricavo inizialmente, quando lo sviluppo richiedeva solo pochi minuti.

Spero di essere stata chiara.
Grazie in anticipo del vostro aiuto
Baci Baci Lu

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 14 gennaio 2007 : 21:11:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non è che l'AgNO3 è sensibile alla luce?

Se c'è qualcuno che usa lo stesso protocollo in qualche laboratorio vicino al tuo potresti farti prestare un po' di reagenti da loro e vedere se i tempi tornano ad essere quelli di prima.

Forse usare vaschette diverse potrebbe non essere una brutta idea, ma non ho mai fatto questo tipo di colorazione quindi non sono sicuro.

PS: se hai voglia perchè non inserisci il protocollo nella sezione protocolli?

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Lucia
Nuovo Arrivato


Prov.: Caserta
Città: Caserta


19 Messaggi

Inserito il - 15 gennaio 2007 : 08:28:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Lucia Invia a Lucia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie Chick80, in realtà non so se il nitrato d'argento è fotosensibile, però il dubbio è venuto anche a me.
Purtroppo non conosco nessuno che usa il protocollo che sto usando quindi....
...mi sa che i prossimi giorni se ne andranno cercando di capire cosa è successo!!!

Vi terrò aggiornati sulle novità, Buona giornata a tutti Lu.
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 15 gennaio 2007 : 11:20:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mi sa che il nitrato d'argento è fotosensibile (in effetti basta pensare al fatto che venga usato in fotografia...)

http://en.wikipedia.org/wiki/Silver_nitrate


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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 15 gennaio 2007 : 12:35:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Lucia,
mi spiace ma ho visto solo oggi questo messaggio.

Allora confermo:
il nitrato di argento è sensibile alla luce e va conservato in bottiglie scure (se non ne hai va bene anche una bottiglia ricoperta con carta stagnola).

Inoltre le vaschette che usi sono di vetro o di plastica?
La plastica non è adatta per questo tipo di colorazione perchè assorbe parte della colorazione, inoltre tutto il materiale che usi (vetro!) deve essere pulito molto bene alrimenti diminuisce la sensibilità e non dovresti neanche toccarli con le mani in quanto le impronte si possono colorare.

Noi adesso usiamo un kit per questa colorazione, ma ho controllato sul libro il vecchio protocollo e corrisponde quasi esattamante al tuo, quindi le uniche cose che ti posso consigliare sono queste!

Spero di essere stata utile!

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CIA
Utente Junior

Gir studying

Prov.: Padova
Città: Rivadolmo


233 Messaggi

Inserito il - 15 gennaio 2007 : 12:40:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CIA  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di CIA  Invia a CIA un messaggio Yahoo! Invia a CIA un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina

il nitrato di argento è sensibile alla luce e va conservato in bottiglie scure (se non ne hai va bene anche una bottiglia ricoperta con carta stagnola).

...

non dovresti neanche toccarli con le mani in quanto le impronte si possono colorare.


Confermo!

CIA
Se è verde o si muove, è biologia. Se puzza, è chimica. Se non funziona, è fisica.
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Lucia
Nuovo Arrivato


Prov.: Caserta
Città: Caserta


19 Messaggi

Inserito il - 15 gennaio 2007 : 21:52:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Lucia Invia a Lucia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao ragazzi e grazie a tutti per la collaborazione. volevo dirvi che oggi ho risolto l'enigma...
sono IO l'artefice dell'errore: la concentrazione di nitrato di argento, deve essere al 0,2% e non al 0,02% (UPS!)... adesso provvedo a correggere il protocollo inserito.
Comunque grazie per i suggerimenti sulla conservazione del nitrato d'argento, li seguirò.
Beh l'unione fa la forza, grazie ancora a tutti.
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CIA
Utente Junior

Gir studying

Prov.: Padova
Città: Rivadolmo


233 Messaggi

Inserito il - 16 gennaio 2007 : 10:48:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CIA  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di CIA  Invia a CIA un messaggio Yahoo! Invia a CIA un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

CIA
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 16 gennaio 2007 : 15:25:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Lucia

... la concentrazione di nitrato di argento, deve essere al 0,2% e non al 0,02% (UPS!)...



OOOOPPPSSS!!!
e il bello è che io avevo pure controllato il protocollo (un po' di fretta in realtà!) e mi era sfuggito quello "0" in più!!!
Pardon!!!
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Lucia
Nuovo Arrivato


Prov.: Caserta
Città: Caserta


19 Messaggi

Inserito il - 16 gennaio 2007 : 22:56:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Lucia Invia a Lucia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Figurati GFPina, sei stata gentilissima.
Ciao a tutti e alla prossima!
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