feeder layer per embryonic like stem cells

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Discussione

car86
Nuovo Arrivato

Città: foggia

12 Messaggi

Inserito il - 20 luglio 2012 : 14:23:08

Ciao a tutti!
Avrei una domanda da farvi.. come si prepara un feeder layer?
Vorrei usare delle staminali mesenchimali come supporto per cellule staminali embryonic-like.
Dopo che le mie mesenchimali hanno raggiunto il livello di confluenza, bisogna irradiarle o ci sono altri modi per inattivarle?
Va bene usare la mitomicina C? I raggi UV?
Non l'ho mai fatto e vorrei avere qualche consiglio!
Grazia in anticipo a tutti!
C86

Citosina
Nuovo Arrivato

Città: Milano

73 Messaggi

Inserito il - 20 luglio 2012 : 23:34:40

Io ho sempre usato i fibroblasti murini embrionali (MEF) come feeder e quello che facevo era di farli arrivare quasi a confluenza, successivamente li trattavo con la mitomicina C. In breve prendevo la petri con le cells e aggiungevo direttamente al terreno la mitomicina C (se ricordo bene a una concentrazione finale di 0.01mg/ml). Facevo movimento a croce e lasciavo in incubatore a 37°C per 1 ora e 30 minuti o anche 2 ore. In seguito eliminavo il terreno con la mitomicina e facevo due lavaggi in PBS. A questo punto stacchi le cells come per splittarle (con trispsina) e poi li puoi piastrare nelle nuove petri alla densità che preferisci. In genere ti consiglio di testarne a diverse densità e vedere cosa è meglio. In ogni caso prima di mettere le staminali, aspettavo due-tre giorni. Il probelma con i fibroblasti è che dopo due settimane circa stavano veramente male e cominciavano a staccarsi in quanto il terreno era per ES e non più per fibroblasti quindi dovevi sempre avere 'scorte' di feeder freschi pronti da usare. Ora con un feeder di staminali mesenchimali non saprei, però.

(la mitomicina che avevo io dovevi prepararla prima, in genere prendevo quella della sigma in polvere e poi la scioglievo in modo da avere una soluzione stock. Poi la conservavo a 4°C e al riparo dalla luce)

car86
Nuovo Arrivato

Città: foggia

12 Messaggi

Inserito il - 23 luglio 2012 : 11:16:11

Grazie mille per la risposta! Farò un tentativo con le mesenchimali, però su alcuni lavori ho letto che vanno bene come feeder layer. Il mio dubbio era fondamentalmente se bastava inattivarli con la mitomicina, o se bisognava irradiarli.. Grazie ancora!!!
Car86