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CRISTIAN
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92 Messaggi

Inserito il - 17 gennaio 2007 : 13:45:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao qualcuno sa aiutarmi?
Sto provando ad estrarre una proteina inserendo un gene in un vettore plasmidico (pcDNA3.1) per trasfezione in cellule di mammifero ma che contiene anche un promotore(T7) per l'espressione in procarioti.
Mi chiedevo se facendo crescere una coltura batterica di E coli contenente il plasmide potevo estrarre la proteina senza effettuare nessuna induzione, per esempio con IPTG come si fa per il plasmide pET21a. o se è necessario cmq indurre l'espressione in qualche modo.
vi allego il plasmide..

Allegato: pcdna3_1dv5histopo_map.pdf
17,09 KB

RM
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 18 gennaio 2007 : 15:45:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se non ricordo male il pcDNA non può esprimere proteine in batteri, perchè non ha la sequenza shine-dalgarno al quale si legano i ribosomi procariotici per l'inizio della traduzione, cioè l'RNA verrà trascritto ma non tradotto. Nel sito invitrogen mi sembra che ne parlino da qualche parte. Ciao

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 18 gennaio 2007 : 17:27:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Cristian!
Scusa ma quello è un plasmide per l'espressione in cellule di mammifero non per l'espressione in batteri!!!
Per esprimere la tua proteine in E. Coli dovresti usare un altro plasmide!

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CRISTIAN
Nuovo Arrivato



92 Messaggi

Inserito il - 18 gennaio 2007 : 19:02:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
LO SO MA VISTO CHE AVEVO GIà IL PLASMIDE PRONTO VOLEVO SAPERE SE POTEVO PRODURRE PIù RAPIDAMENTE CMQ UN Pò DI PROTEINA DAI BATTERI, POI CON CALMA FACCIO L'ESPRESSIONE IN CELLULE EUCARIOTICHE. IL VETTORE HA IL PROMOTORE BATTERICO E QUINDI PENSAVO CHE UN Pò DI PROTEINA DOVREBBE PRODURLA.. ALTRIMENTI DOVREI PREPARARE DA CAPO UN PET21 MA VOLEVO FARE UN TENTATIVO CON pcDNA3.1 ..CHE DICI?
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 18 gennaio 2007 : 20:15:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mi pare strano che ci sia un promotore batterico senza una ribosome-binding sequence
associata. Delle due l'una: o il promotore non è batterico o la RBS c'è.
Trattandosi di pcDNA3.1, io direi che di promotori batterici non dovrebbero essercene,
visto che è un vettore per l'espressione in mammiferi.

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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CRISTIAN
Nuovo Arrivato



92 Messaggi

Inserito il - 19 gennaio 2007 : 10:21:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma T7 non è un promotore batterico?ma forse avete ragione, serve solo per la trascrizione..
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AleXo
Moderatore

OrniAle

Prov.: Estero
Città: San Francisco, California


1550 Messaggi

Inserito il - 19 gennaio 2007 : 11:14:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AleXo  Invia a AleXo un messaggio AOL Invia a AleXo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Perchè non subcloni in un vettore dedicato ai procarioti? Al massimo ti prenderà un paio di giorni.

Più che altro non capisco perchè vuoi esprimerla senza indurre...curiosità!

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CRISTIAN
Nuovo Arrivato



92 Messaggi

Inserito il - 19 gennaio 2007 : 12:47:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Perchè avevo già il plasmide pronto..e inserirla in un pET21 mi porta via un pò di tempo.. era solo per curiosità..non è che voglio esprimere senza indurre(l'induzione in questo plasmide non serve) volevo solo avere rapidamente un pò di proteina da usare come contr positivo
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Alebiotech
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 08 gennaio 2009 : 15:05:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Alebiotech Invia a Alebiotech un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
T7 credo sia una polimerasi virale. Dovresti inserire anche un plasmide contenente il gene della T7 sotto il promotore lac così inducendo con IPTG avresti l'espressione di T7 che a sua volta trascrive il gene della tua proteina. da solo pcDNA3.1 secondo me non funziona per l'espressione il batteri
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