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bl187
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 27 agosto 2012 : 20:40:30
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Ciao a tutti, scusate se apro la discussione in due aree diverse, sono nuova e non mi ero accorta delle varie sezioni.
Spero che qualcuno possa risolvere il mio problema.
1) Ho trasfettato due diverse linee cellulari con siRNA Dharmacon per silenziare la proteina di mio interesse --> OK
2) Real Time PCR: ho ottenuto una riduzione del messaggero di circa l'80% in entrambe le linee --> OK
3) Western Blot: la proteina diminuisce sensibilmente soltanto in una delle due linee cellulari --> Come può spiegarsi questo fatto?
Il turnover di una proteina è uguale in tutte le linee cellulari? Può essere un problema di prevalenza di isoforme?
Scusate se pongo una domanda stupida. Ringrazio in anticipo tutti coloro che interverranno.
Saluti
Barbara
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
 Inserito il - 03 settembre 2012 : 22:33:47
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Ciao, domanda interessante.
Il turnover di una proteina può essere ben diverso in due linee cellulari diverse, può darsi che in una delle tue linee la proteina sia stabilizzata comunque da qualche altro fattore. Parli di isoforme diverse: sei sicura che il tuo anticorpo riconosca una sola isoforma, quella per cui stai facendo il knock-down, e non altre? |
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bl187
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 03 settembre 2012 : 23:17:09
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Ciao, grazie mille per il suggerimento.
Il mio anticorpo riconosce un epitopo che in effetti contiene una porzione soggetta a splicing alternativo. Tuttavia, ho controllato anche le sequenze target di tutti i miei siRNA: vengono bersagliate solo parti di mRNA comuni a tutte le isoforme. Il mistero si infittisce...
Proverò a testare l'efficacia del silenziamento dopo un tempo maggiore, così almeno potrò sondare l'ipotesi "turnover diverso".
Ancora grazie
Barbara |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2012 : 00:14:58
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| Di nulla, la mia è comunque solo un'ipotesi. In effetti se "bersagli" porzioni comuni di mRNA dovresti avere una diminuzione di tutte le isoforme che possiedono quella porzione comune. I dati real time si riferiscono a una particolare isoforma? |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2012 : 00:54:37
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Queste cose possono accadere, generalmente per fare RNAi si da anche un mix di tre double strand o hairpin, ognuno dei quali bersaglia una regione diversa del messaggero.
Come non detto, mi accorgo solo ora che già usi più siRNA. |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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bl187
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2012 : 04:46:46
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Ehm, no... Non ho ancora controllato dove si appaiano i miei primer (ho acquistato comodamente una mix F+R già pronta). Controllerò. Quale informazione posso ricavarne?
Ri-grazie
Barbara
Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
Di nulla, la mia è comunque solo un'ipotesi. In effetti se "bersagli" porzioni comuni di mRNA dovresti avere una diminuzione di tutte le isoforme che possiedono quella porzione comune. I dati real time si riferiscono a una particolare isoforma?
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 05 settembre 2012 : 19:29:46
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| beh direi di controllare... magari i tuoi primer eliminano una isoforma ma nn altre... inoltre le tue linee cellulari potrebbero esprimere le varie isoforme in quantità diverse... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 settembre 2012 : 00:33:45
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Ma scusa se hai isoforme* dovute a splicing alternativo è difficle che abbiamo la stessa lunghezza! Anche se l'anticorpo riconosce le due isoforme in WB dovresti riconoscere le due bande diverse!
* N.B. in realtà sarebbe più corretto parlare di "varianti" che non di isoforme! |
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Discussione |
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Perplessità su RNA interference
Didattica
