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bl187
Nuovo Arrivato



6 Messaggi

Inserito il - 27 agosto 2012 : 20:40:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di bl187 Invia a bl187 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, scusate se apro la discussione in due aree diverse, sono nuova e non mi ero accorta delle varie sezioni.

Spero che qualcuno possa risolvere il mio problema.

1) Ho trasfettato due diverse linee cellulari con siRNA Dharmacon per silenziare la proteina di mio interesse --> OK

2) Real Time PCR: ho ottenuto una riduzione del messaggero di circa l'80% in entrambe le linee --> OK

3) Western Blot: la proteina diminuisce sensibilmente soltanto in una delle due linee cellulari --> Come può spiegarsi questo fatto?

Il turnover di una proteina è uguale in tutte le linee cellulari? Può essere un problema di prevalenza di isoforme?

Scusate se pongo una domanda stupida. Ringrazio in anticipo tutti coloro che interverranno.

Saluti

Barbara

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 03 settembre 2012 : 22:33:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao, domanda interessante.
Il turnover di una proteina può essere ben diverso in due linee cellulari diverse, può darsi che in una delle tue linee la proteina sia stabilizzata comunque da qualche altro fattore. Parli di isoforme diverse: sei sicura che il tuo anticorpo riconosca una sola isoforma, quella per cui stai facendo il knock-down, e non altre?

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bl187
Nuovo Arrivato



6 Messaggi

Inserito il - 03 settembre 2012 : 23:17:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di bl187 Invia a bl187 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao, grazie mille per il suggerimento.

Il mio anticorpo riconosce un epitopo che in effetti contiene una porzione soggetta a splicing alternativo. Tuttavia, ho controllato anche le sequenze target di tutti i miei siRNA: vengono bersagliate solo parti di mRNA comuni a tutte le isoforme. Il mistero si infittisce...

Proverò a testare l'efficacia del silenziamento dopo un tempo maggiore, così almeno potrò sondare l'ipotesi "turnover diverso".

Ancora grazie

Barbara
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 04 settembre 2012 : 00:14:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Di nulla, la mia è comunque solo un'ipotesi. In effetti se "bersagli" porzioni comuni di mRNA dovresti avere una diminuzione di tutte le isoforme che possiedono quella porzione comune. I dati real time si riferiscono a una particolare isoforma?

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zerhos
Utente Junior

ZERHOS

Prov.: Pisa
Città: Pisa


421 Messaggi

Inserito il - 04 settembre 2012 : 00:54:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zerhos  Invia a zerhos un messaggio ICQ Invia a zerhos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Queste cose possono accadere, generalmente per fare RNAi si da anche un mix di tre double strand o hairpin, ognuno dei quali bersaglia una regione diversa del messaggero.

Come non detto, mi accorgo solo ora che già usi più siRNA.

"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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bl187
Nuovo Arrivato



6 Messaggi

Inserito il - 04 settembre 2012 : 04:46:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di bl187 Invia a bl187 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ehm, no... Non ho ancora controllato dove si appaiano i miei primer (ho acquistato comodamente una mix F+R già pronta). Controllerò. Quale informazione posso ricavarne?

Ri-grazie
Barbara

Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer

Di nulla, la mia è comunque solo un'ipotesi. In effetti se "bersagli" porzioni comuni di mRNA dovresti avere una diminuzione di tutte le isoforme che possiedono quella porzione comune. I dati real time si riferiscono a una particolare isoforma?

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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 05 settembre 2012 : 19:29:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
beh direi di controllare... magari i tuoi primer eliminano una isoforma ma nn altre... inoltre le tue linee cellulari potrebbero esprimere le varie isoforme in quantità diverse...

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 06 settembre 2012 : 00:33:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma scusa se hai isoforme* dovute a splicing alternativo è difficle che abbiamo la stessa lunghezza! Anche se l'anticorpo riconosce le due isoforme in WB dovresti riconoscere le due bande diverse!



* N.B. in realtà sarebbe più corretto parlare di "varianti" che non di isoforme!
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