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VodooDna
Nuovo Arrivato

2 Messaggi

Inserito il - 22 gennaio 2007 : 12:10:42

potrebbe qualcuno descrivermi in dettaglio e in modo chiaro cos'è e come si effettua una snupe????
HELP ME!!!!

VodooDna

chick80
Moderatore

Città: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 22 gennaio 2007 : 23:51:24

Innanzitutto il link a un articolo che descrive la tecnica e una sua applicazione per determinare la presenza di mutazioni puntiformi:
Single nucleotide primer extension to detect genetic diseases: experimental application to hemophilia B (factor IX) and cystic fibrosis genes. - PNAS 1991 Feb 15;88(4):1143-7

Dall'abstract del lavoro (un po' modificato):
Come prima cosa si fa una PCR del frammento di DNA contenente il sito putativo di mutazione.
Per ciascun frammento vengono preparate due mix, entrambe contenenti il frammento amplificato (quindi il tuo prodotto di PCR) e un primer (18bp o più) la cui sequenza è identica a quella del gene normale e fiancheggia il 5' del sito della mutazione. In una delle 2 mix metti un nucleotide marcato con 32P uguale a quello presente nella sequenza normale e nell'altra un nucleotide marcato con 32P uguale a quello mutato.
A questo punto fai una single-nucleotide primer extension, che essenzialmente consiste nell'aggiungere della Taq e un buffer appropriato alle tue 2 mix e fare un ciclo di PCR. In questo modo i primers incorporeranno l'uno o l'altro nucleotide marcato a seconda di che alleli sono presenti sul frammento amplificato nel primo step.
A questo punto fai correre il prodotto di questa amplificazione su gel di poliacrilamide e ne fai una autoradiografia.

Vedrai:
omozigote normale -> segnale solo nella mix con il nucleotide normale
omozigote mutato -> segnale solo nella mix con il nucleotide mutato
eterozigote -> segnale in entrambe le mix.

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