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domi84
Moderatore

Smile3D
Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 25 settembre 2012 : 17:16:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sto provando a trasfettare delle cellule con un siRNA verso la proteina che voglio studiare. Per essere sicuro che la trasfezione del siRNA sta avvenendo vorrei portarmi un controllo positivo. Le company ne forniscono molti da acquistare (a caro prezzo), ma non mi danno la sequenza (ovviamente).
Qualcuno ha la sequenza di un siRNA verso un controllo positivo, così posso farlo sintetizzare? Tipo GAPDH o cose così?!


Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 25 settembre 2012 : 20:15:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ma se e' un controllo solo per la trasfezione, non potresti fare un siRNA per GFP (che trasfetti insieme al siRNA anti-GFP)?

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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2012 : 06:55:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scritto da MolecularLab Mobile

Eh? scusa, ma mi sono perso qualcosa :-) !
Io non trasfetto GFP...
Dovrei trasfettare GFP e poi anche un siRna contro GFP?

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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2012 : 08:40:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
beh si dovresti trasfettare anche la gfp... forse così è + complicato però era solo una idea. Se vuoi un controllo positivo endogeno, puoi usare gapdh come tu stesso hai detto; magari trovi la sequenza in letteratura no? hai cercato? In ogni caso, c'è differenza in termini di costo tra comprarlo già sintetizzato dalla company oppure fornire la sequenza e farlo sintetizzare?

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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2012 : 09:22:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer

magari trovi la sequenza in letteratura no? hai cercato? In ogni caso, c'è differenza in termini di costo tra comprarlo già sintetizzato dalla company oppure fornire la sequenza e farlo sintetizzare?


Ho cercato in letteratura ma non l'ho (ancora) trovato. Sintetizzarlo costa una 60ina di €, comprarlo almeno il doppio...

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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2012 : 10:43:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
forse non ho capito bene, ma io non spenderei in un controllo di trasfezione del siRNA. Mi spiego, come controllo puoi usare uno scramble, ma per vedere l'efficacia del silenziamento (e quindi, ancora più a monte, l'efficacia della trasfezione) ti basta il wb della proteina a 12, 24, 48 e 72h come inizio. Se in parallelo ti trasfetti un siRNA per qualsiasi altra cosa (GAPDH, GFP o mostri vari), chi ti dice che l'efficienza di trasfezione del siRNA controllo sia uguale a quella del siRNA di interesse? E chi ti dice che il silenziamento di GAPDH (o chi per essa) non sia talmente tossico da ucciderti le cellule? In questo caso l'efficienza è imparagonabile.
che ne pensi?

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2012 : 12:12:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Domi ma la domanda principale è: "a cosa ti serve questo controllo?"
Ovviamente ogni controllo è diverso in base allo scopo per cui si usa, - un controllo scrambled come suggerisce Iside è un controllo negativo che ti serve per dimostrare che gli effetti che vedi siano dovuti effettivamente al silenziamento del tuo gene e non ad altro
- un controllo fatto con un siRNA contro un gene HK ti serve come controllo positivo per valutare che tutte le condizioni del tuo esperimento siano ottimali e che stia funzionando il silenziamento (ovviamente con tutte le restrizioni del caso, dato che non è detto che l'efficienza di silenziamento del controllo e del tuo gene siano uguali)
- un controllo di trasfezione invece generalmente è banalmente una sostanza fluorescente che ti permette osservando al microscopio qual è l'efficienza di trasfezione.
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2012 : 12:35:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Evidentemente non mi sono spiegato. Mi impegnerò questa volta!
Devo trasfettare queste cellule particolamente restie alla trasfezione (MEF). Sto usando questa interferin (tipo di lipofectamine, tanto per capirci) con un sirna (pubblicato su un lavoro) per la mia proteina di interesse. Dal WB non vedo diminuire la proteina e non so se è il sirna che non va bene, o è la trasfezione che non ha successo.
Citazione:

Se in parallelo ti trasfetti un siRNA per qualsiasi altra cosa (GAPDH, GFP o mostri vari), chi ti dice che l'efficienza di trasfezione del siRNA controllo sia uguale a quella del siRNA di interesse? E chi ti dice che il silenziamento di GAPDH (o chi per essa) non sia talmente tossico da ucciderti le cellule? In questo caso l'efficienza è imparagonabile.
che ne pensi?


Non mi interessa sapere esattamente l'efficienza di trasfezione, mi interessa soltanto sapere se la tecnica funziona (visto che è la prima volta che la faccio)
Citazione:

un controllo fatto con un siRNA contro un gene HK ti serve come controllo positivo per valutare che tutte le condizioni del tuo esperimento siano ottimali e che stia funzionando il silenziamento (ovviamente con tutte le restrizioni del caso, dato che non è detto che l'efficienza di silenziamento del controllo e del tuo gene siano uguali)


è proprio questo quello che mi serve...

(ovviamente porto come controllo negativo lo scrambled...ma non è questo il mio problema ora)

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2012 : 13:12:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok, in effetti mi sembrava che fosse quello che chiedevi, ma anche visto le successive risposte meglio essere sicuri!

In ogni caso, io una sequenza di un siRNA per un HK non ce l'ho.
E' vero che prenderlo già fatto costa di più ma sono siRNA testati e garantiti, fai attenzione che uno disegnato da te (o preso da qualcuno) non è detto che funzioni allo stesso modo.
In ogni caso un controllo di trasfezione ti conviene comunque utilizzarlo, a maggior ragione se è la prima volta che transfetti quelle cellule e usi quella sostanza.
Poi per la sequenza del controllo positivo, mi spiace ma purtroppo non posso aiutarti e posso solo consigliarti di continuare a controllare in letteratura.

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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2012 : 18:20:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Trovato (quasi):
https://www.qiagen.com/geneglobe/sirnacontrolview.aspx?keepresult=true&producttype=66&ID=1022564&ShowSiRnaControls=1
Qui è indicato il siRNA controllo positivo per Mm/Hs MAPK1, ed il costo è come quelli di sintesi...
Il problema è che non ho nè primer nè Ab per MAPK1...quindi avrei bisogno di primer collaudati per MAPK1 e siamo punto e accapo.

Forse compro questi, sembrano buoni, utili in mouse e human, e abbiamo già i primer per GAPDH
http://products.invitrogen.com/ivgn/product/AM4624

(Qui una spiegazione molto chiara sui controlli per siRNA:
http://www.biocompare.com/Product-Reviews/40344-Silencer-GAPDH-siRNA-Human-Mouse-Rat-From-Ambion-For-The-Determination-Of-Tranfection-Efficiency/)

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2012 : 22:43:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da domi84

Trovato (quasi):
https://www.qiagen.com/geneglobe/sirnacontrolview.aspx?keepresult=true&producttype=66&ID=1022564&ShowSiRnaControls=1
Qui è indicato il siRNA controllo positivo per Mm/Hs MAPK1, ed il costo è come quelli di sintesi...

Magari è una domanda stupida, ma ti sei accorto che quello è il link per i primers?

Quelli dell'Invitrogen sicuramnte saranno buoni, se il problema non è poi il prezzo.
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