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metilp
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3 Messaggi

Inserito il - 04 ottobre 2012 : 21:07:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di metilp Invia a metilp un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti!!
Ho un problema con l'amplificazione di un frammento, che devo successivamente sottoporre a restrizione enzimatica (all'interno c'Ŕ uno SNP!).
Inizialamente sono riuscita a mettere a punto il protocollo (dopo un gradient che mi ha dato delle bellissime bande)ed effettuare la PCR e la successiva genotipizzazione di una ventina di campioni.
Da qualche settimana Ŕ sorto il problema: oltre ad avere il mio frammento di 350 bp, quando controllo la PCR ritrovo anche una strisciata di aspecifico compresa tra 100 e 250 bp, che da molti probelmi dopo la digestione, dato che quella Ŕ la zona del gel dove dovrebbero esserci le bande della digestione.
Ho provato a cambiare tutto (H2O, Taq, Primer, dNTP) e so che non si tratta di contaminazione perchŔ altri polimorfismi vengono molto bene...
Spero che qualcuno possa avere un suggerimento per cercare di eliminare l'aspecifico!...
Grazie!!

mollichina di pane
Utente Junior

Miyu



121 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2012 : 21:00:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mollichina di pane Invia a mollichina di pane un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao metilp!
dunque...d˛ per scontato che tu abbia fatto un bianco nella tua pcr per dire con certezza che non ci sono contaminazioni.
Dal mio punto di vista potresti eliminare il problema correndo tutta la pcr che hai e tagliandoti poi solo la banda d'interesse. A quel punto purifichi da gel con kit o con un protocollo home-made e poi passi alla restrizione. E' certamente pi¨ veloce. Altrimenti devi giocare con la Ta. Alcuni tipi di polimerasi fanno questo genere di smear!
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