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 Soppressione mutazioni amber (non senso)
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Selenocisteina
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lucy


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Inserito il - 05 ottobre 2012 : 17:45:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Selenocisteina Invia a Selenocisteina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Innanzitutto scusate se il topic è un doppione, ho cercato e non ho trovato altri topic già aperti! La mia domanda era: ma la soppressione di mutazioni non senso tramite l'utilizzo di tRNA con l'anticodone complementare a un codone di stop, perché non interferiscono con la sintesi di tutte le altre proteine? O lo fanno, ma siccome i trascritti (sto parlando di procarioti, per gli eucarioti non so se si usino questo tipo di soppressori) vengono comunque terminati poche bp a valle dal codone di stop non si hanno mai gravi problemi nelle proteine non mutate?

Spero si capisca la domanda! :)

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 05 ottobre 2012 : 23:13:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No non mi risulta che ci sia un topic al riguardo, tra l'altro è una domanda interessante.
(simpatico anche il fatto che questa domanda sia fatta da "selenocisteina" )

In realtà ci possono essere, come ipotizzavi tu, dei difetti anche nelle altre proteine e le cellule possono avere dei problemi, ma in genere non molto gravi. Le motivazioni sono varie, la prima che spiega solo in piccolissima parte perchè i soppressori non siano tossici è che il codone di stop non è uno, ma ce ne sono un paio di seguito quindi se non funziona uno funzionerà l'altro, questo però è valido solo per alcuni geni. Una motivazione più convincente è che in realtà i soppressori non sono così efficienti, non funzionano al 100%, questo fa sì che da un lato esplichino la funzione di soppressore perché anche se non "sopprimono" la mutazione in tutti i trascritti in cui questa è presente consentono comunque la produzione di una certa quantità di proteina che è sufficiente a revertire il fenotipo mutante, ma dall'altro non risultano così tossici per le altre proteine.
Inoltre ci sono vari tipi di soppressori, i soppressori amber risultano in genere meno tossici rispetto ai soppressori ocra in quanto la maggior pare dei geni batterici terminano con il codone di stop ocra.
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 06 ottobre 2012 : 09:57:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Parlavo di questa cosa recentemente con una persona che si occupa dell'opposto, ossia di fare degli esperimenti di "expanded genetic code", per inserire aminoacidi modificati in punti arbitrari di una proteina, ed in effetti mi ha dato la stessa risposta di GFPina (la seconda parte almeno)

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Selenocisteina
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lucy



64 Messaggi

Inserito il - 06 ottobre 2012 : 13:25:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Selenocisteina Invia a Selenocisteina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille delle risposte!
Comunque, quindi alla fin fine non è un metodo così ortodosso, perché va bene che se ritorna il fenotipo non mutato si può dire che la mutazione è soppressa, ma in fin dei conti credo che le cellule col soppressore non abbiano mai un fenotipo troppo simile al ceppo wild-type, perché appunto avranno una serie di problemi (anche se, come dice GFPina, non così evidenti)...
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2012 : 09:59:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Selenocisteina

Comunque, quindi alla fin fine non è un metodo così ortodosso, ...

in che senso non è un metodo ortodosso?
È un metodo che viene utilizzato per fare degli studi sulle proteine, non come "cura" per ristabilire il fenotipo w.t.
Ad es. voglio studiare l'effetto di una mutazione all'aminoacido 33 di una proteina, faccio il mutante mettendo il codone di stop in quella posizione e poi lo metto in vari ceppi soprressori che a secondo del tRNA-sup che posseggono inseriranno aminoacidi diversi e posso vedere in quali casi si produce una proteina funzionale.

Citazione:
Messaggio inserito da Selenocisteina

perché va bene che se ritorna il fenotipo non mutato si può dire che la mutazione è soppressa,

attenzione che non sempre viene ristabilita la proteina w.t. puoi avere soppressione perchè comunque viene messo un AA e la proteina non e tronca, ma potrebbe anche essere meno funzionale di quella w.t.

Citazione:
Messaggio inserito da Selenocisteina

ma in fin dei conti credo che le cellule col soppressore non abbiano mai un fenotipo troppo simile al ceppo wild-type, perché appunto avranno una serie di problemi (anche se, come dice GFPina, non così evidenti)...

i ceppi soppressori di per sé presentano un fenotipo leggermente alterato e in genere hanno dei probelmi di crescita e non sono come i ceppi w.t. (a prescindere dalla proteina mutata che voglio studiare)

Per rispondere ad una cosa che dicevi all'inizio e che mi era sfuggita:
Citazione:
sto parlando di procarioti, per gli eucarioti non so se si usino questo tipo di soppressori)

i soppressori sono tollerati solo nei procarioti e negli eucarioti inferiori, mentre negli eucarioti superiori risultano letali.
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2012 : 11:53:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
i soppressori sono tollerati solo nei procarioti e negli eucarioti inferiori, mentre negli eucarioti superiori risultano letali.


Attenzione che invece per quello che dicevo io (espansione del codice genetico) la cosa si fa tranquillamente negli eucarioti.

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Selenocisteina
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lucy



64 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2012 : 13:15:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Selenocisteina Invia a Selenocisteina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie anche dei chiarimenti. :)
Con non ortodosso intendevo che in realtà non mi pare sia un metodo molto preciso e "pulito", perché comunque la soppressione idealmente dovrebbe solo andare a sopprimere la mutazione, appunto (o comunque agire solo su quel gene), mentre invece qui secondo me potrebbe scatenare un sacco di fenotipi collaterali.
Non so bene gli altri metodi di soppressione quanto diano questi problemi, ma secondo me almeno "idealmente" ne dovrebbero dare di meno...
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 08 ottobre 2012 : 20:43:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Selenocisteina

Grazie anche dei chiarimenti. :)
Con non ortodosso intendevo che in realtà non mi pare sia un metodo molto preciso e "pulito", perché comunque la soppressione idealmente dovrebbe solo andare a sopprimere la mutazione, appunto (o comunque agire solo su quel gene), mentre invece qui secondo me potrebbe scatenare un sacco di fenotipi collaterali.
Non so bene gli altri metodi di soppressione quanto diano questi problemi, ma secondo me almeno "idealmente" ne dovrebbero dare di meno...


Mi sembrava di averlo spiegato, ma evidentemente non sonomstata chiara.
Il fatto è che devi "cambiare" il tuo punto di vista. I tRNA soppressori si chiamano così perché "sopprimono" il fenotipo dovuto alla mutazione, ok ma il punto è che "non è quello lo scopo", lo scopo non e ristabilire il fenotipo w.t.
La loro importanza è un'altra, ovvero sono un utilie metodo per studiare i processi di traduzione.
Posso essere usati come ti dicevo nell'esempio precedente per vedere l'effetto della presenza di diversi aminoacidi in una determinata posizione di una proteina, sono stati "fondamentali" per capire come funzionano i tRNA e la loro forza è appunto il fatto di avere una funzione non ottimale. Il tRNA sopressore deve "lottare" contro altri fattori cellulari per esplicare la sua funzione, ad es. i soppressori non-senso devono competere con i fattori di rilascio che si legano nei pressi del codone di stop e questo è stata sfruttato per capire come funzinano i tRNA e quali sono le sequenze "importanti" dei tRNA stessi. Sono stati fatti dei mutanti dello stesso tRNA soppressore andando a mutagenizzare altre parti della sequenza (non l'anticodone) e si è visto che non solo l'anticodone stesso è inportante per il ricnoscimento del codone, ma anche il suo intorno (le parti di sequenza vicine).
È questa la loro importanza, non il fatto che "sopprimono" la mutazione.
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Selenocisteina
Nuovo Arrivato

lucy



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Inserito il - 12 ottobre 2012 : 14:43:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Selenocisteina Invia a Selenocisteina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì hai ragione scusa, mi sa che stiamo parlando di due punti di vista diversi ed è dovuto al fatto che non ho specificato da dove mi sia nato il dubbio nemmeno dopo il tuo primo post, dove in effetti dicevi che non viene usato per ripristinare il fenotipo wt.

Sono d'accordo con tutto quello che hai scritto, però la mia domanda era nata dal fatto che ho letto le descrizioni di alcuni lavori in cui i tRNA soppressori sono stati usati per creare dei "mutanti condizionali" di virus (o letali, nel senso che diventavano incapaci di lisare, oppure incapaci di svolgere alcuni processi secondari). Questo è stato fatto infettando dei batteri che portavano il tRNA soppressore di una mutazione sul virus sotto promotore inducibile / reprimibile, per andare a vedere il comportamento del virus in condizioni permissive o non (col tRNA indotto o no).

In questi lavori specificava che la presenza del soppressore ripristinava il fenotipo wild-type (del virus), anche se comunque non ho letto gli articoli bensì delle lezioni, quindi potrebbe anche essere un fraintendimento di chi li ha riassunti. :)

In questo caso avevo pensato che, trattandosi di virus, magari il problema che ho esposto nella prima domanda non si pone, perché alla fin fine il metabolismo del batterio infetto viene già per benino "devastato" dal virus e quindi qualche proteina scassata in più non penso gli faccia grande differenza, e il virus penso se la possa cavare lo stesso anche se qualche ORF gli si allunga (anche perché, come mi sembra che abbia detto anche tu, credo che comunque i tRNA soppressori siano in concentrazioni più basse del "richiesto", perciò non andranno troppo a interferire con la sintesi di proteine)...

Però, da come era spiegata la cosa, sembrava che casi analoghi di "mutanti condizionali" venissero usati anche per geni batterici, e secondo me appunto in questo caso si tratterebbe un metodo un po' troppo "sporco", e da qui mi era nata la domanda.
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