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 Variazione d'Assorbanza come stima dell VelocitÓ di reazione
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Gr÷n
Utente Junior



220 Messaggi

Inserito il - 09 novembre 2012 : 13:37:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gr÷n Invia a Gr÷n un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
..Il titolo Ŕ scritto in un linguaggio quasi sms-ese per mancanza di spazio e sarebbe pi¨ propriamente:

"La variazione di assorbanza come stima INDIRETTA della velocitÓ di una reazione catalizzata da enzima".

Ho bisogno di un parere, possibilmente esperto, di chi Ŕ avvezzo a lavorare con grafici che chiamino in causa l'assorbanza. Segue il mio quesito specifico.

_

Puta caso che in una cuvetta abbia inserito 200microlitri di substrato S, 400 microlitri di soluzione buffer (per stabilizzare al meglio l'enzima) e 400 microlitri estratto d'enzima, per un totale di 1 mL. La chiamiamo CUVETTA 1.

E puta caso che in una seconda cuvetta abbia invece inserito sempre 200microlitri di substrato S, ma solo 100 microlitri di estratto d'enzima (e quindi, i restanti 700 di buffer, per arrivare sempre ad 1mL totale di volume). QUesta la chiamiamo CUVETTA 2.

Praticamente, la prima cuvetta ha maggior concentrazione enzimatica della seconda. La concentrazione di substrato Ŕ invece identica per entrambe.

In entrambe le soluzioni avrÓ luogo una reazione di conversione enzimatica di substrato in prodotto S->P. Badate che l'enzima NON gode di regolazione allosterica, ma rispetta la cinetica di Michaelis Menten.

Immaginate che il prodotto P sia colorato, e capace di interagire con le lunghezze d'onda di uno spettrofotometro: e che quindi sia possibile seguire l'aumento di concentrazione del prodotto come aumento del valore di assorbanza.

_

Ora. Se io potessi costruire un grafico di Assorbanza in funzione del tempo per entrambi i "sistemi" (ossia, per le CUVETTE 1 e 2) noterei che la curva relativa alla CUVETTA 1 sia pi¨ "alta" rispetto alla seconda, perchÚ la reazione di conversione di S in Prodotto P colorato Ŕ assai pi¨ rapida, vista la maggiore concentrazione di enzima.

In altre parole: assister˛ ad una formazione di prodotto pi¨ veloce nella CUVETTA 1, e quindi ad un pi¨ repentino aumento del valore di assorbanza (dato che, se aumenta rapidamente la concentrazione di P colorato, aumenterÓ rapidamente pure la sua assorbanza). Fino a quando chiaramente il substrato disponibile si sarÓ grosso modo esaurito e quindi pi¨ di tanto prodotto non si formerÓ: il valore di assorbanza si sarÓ stabilizzato.

_

Tuttavia, PRIMA O POI, anche nella CUVETTA 2, quella con meno enzima, tutto il substrato sarÓ stato convertito in prodotto colorato, e quindi la curva della CUVETTA 2 dovrebbe raggiungere (dopo molto tempo) lo STESSO valore di assorbanza che la CUVETTA 1 aveva raggiunto molto prima. E' esatto?

Questo mi porta a concludere che la curva della variazione di assorbanza (y) nel tempo (x) NON E' ESATTAMENTE ASSIMILABILE ad una curva della variazione della velocitÓ di reazione (y) in funzione della concentrazione di substrato (x).

..PerchÚ se Ŕ vero che la quantitÓ di enzima condiziona la massima velocitÓ possibile di catalisi(e quindi, condiziona la cinetica enzimatica complessiva) - non Ŕ altrettanto vero che la conc. di enzima influenzi il valore massimo di assorbanza raggiungibile! Semmai, condiziona il TEMPO necessario a registrare un certo valore massimo di assorbanza. E' esatto?

_

Per questo motivo, son portato a pensare che mentre le curve della cinetica enzimatica (v0 in funzione di [S]) siano effettivamente due classiche iperboli di Michaelis Menten (con quella della cuvetta 2 pi¨ "bassa" rispetto a quella cuvetta 1), cioŔ cosý:

http://i49.tinypic.com/2pziups.png

..le curve della variazione di assorbanza siano in realtÓ un po' diverse, ed in particolare: per la CUVETTA 1 una iperbole, mentre per la CUVETTA2 una retta quasi lineare "in ascesa", a dimostrare il fatto che non sia ancora stato raggiunto il valore massimo di assorbanza e che ci sia "ancora altro substrato da convertire prima che la situazione dell'assorbanza si stabilizzi, solo che essendoci meno enzima, il tutto procede pi¨ lentamente". Cosý:

http://i46.tinypic.com/24csbgp.png

_

Vi trovate con quello che ho detto oppure ho sparato una marea di castronerie? xD

Grazie in anticipo - specialmente a chi dovesse impiegare del tempo nella lettura del mio quesito!

Gr÷n
Utente Junior



220 Messaggi

Inserito il - 11 novembre 2012 : 13:19:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gr÷n Invia a Gr÷n un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Forse la domanda fa un po' spavento :D

_

Provo a riformularla in un altro modo.

Vi risulta che, se ci sia troppo poco enzima (catalizzante una reazione che, a partire da un substrato otticamente inattivo, produce un prodotto colorato e capace di assorbire la luce) la variazione di assorbanza nel tempo sia cosý scarsa da presentarsi come una curva lineare?

Come nella curva blu?

http://i46.tinypic.com/24csbgp.png

_

E allorquando l'enzima dovesse saturarsi, nonostante la lentezza, raggiungerebbe comunque il classico "plateau iperbolico" ?
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chick80
Moderatore

DNA

CittÓ: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 11 novembre 2012 : 13:35:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sono di fretta e non ho tempo di leggere tutto... ma conta che se consideri solo la prima parte della curva rossa hai di fatto qualcosa che assomiglia molto alla tua curva blu, solo con cinetica molto pi¨ veloce.

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AntonioSillo
Nuovo Arrivato



61 Messaggi

Inserito il - 18 novembre 2012 : 14:26:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AntonioSillo Invia a AntonioSillo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il ragionamento fila! In ogni caso, quando studi l'attivitÓ enzimatica, (in questo caso stiamo parlando evidentemente di quella) non devi tanto vedere l'andamento della curva in tutto il tempo, ma solo nei primi istanti di tempo.
Questo poichŔ, per il principio delle velocitÓ iniziali, reazioni con cinetica complessa come quelle enzimatiche seguono un andamento lineare solo nei primi istanti di tempo. Poi subentrano atri fattori che determinano deviazioni dalla linearitÓ.
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Gr÷n
Utente Junior



220 Messaggi

Inserito il - 19 novembre 2012 : 19:44:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gr÷n Invia a Gr÷n un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie Chick - ed anche a te, AntonioSillo!

_

Ho un'altra domanda veloce a tal riguardo.

Nella cinetica di Michaelis-Menten, la curva iperbolica protende asintoticamente verso il valore di vMax. C'Ŕ da dire per˛ che nella cinetica di Michaelis-Menten si dÓ per assunto che la concentrazione di substrato (asse delle ordinate) possa essere incrementata indefinitamente.

In un sistema "reale", come appunto una delle cuvette dell'esempio di cui sopra, la concentrazione di substrato Ŕ limitata nel tempo e prima o poi sarÓ consumata dall'attivitÓ enzimatica.

Quindi, mi aspetto che questa curva, dopo aver raggiunto un certo plateau, possa anche "inflettersi" un po' verso il basso a seguito dell'esaurimento di substrato (e quindi della minore probabilitÓ statistica d'imbattersi in urti/collisioni tra enzima e substrato) - in questo modo:

http://i50.tinypic.com/2ce2iq8.png

E' esatto?


____

Per˛ dal punto di vista del grafico "assorbanza in funzione del tempo" questo non dovrebbe essere vero! Infatti, la concentrazione del prodotto colorato determina l'incremento d'assorbanza - ma una volta che il prodotto si Ŕ formato, salvo reversibilitÓ della reazione, non dovrebbe assistersi ad un calo del valore di assorbanza relativo alla diminuita concentrazione di substrato: il prodotto colorato che si Ŕ formato c'Ŕ e resta!. E' esatta anche questa considerazione?

Un saluto!

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AntonioSillo
Nuovo Arrivato



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Inserito il - 20 novembre 2012 : 22:01:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AntonioSillo Invia a AntonioSillo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
direi pi¨ che altro che in un sistema reale la cinetica di M.M. e quindi la linearitÓ della velocitÓ con la concentrazione di substrato, viene osservata nei primi istanti di tempo. poi si devia dalla linearitÓ perchŔ ci possono essere cmq degli effetti di modulazione allosterica, e poichŔ cmq la cinetica di reazione inizia a non essere pi¨ del primo ordine e a dipendere da altri fattori. il grafico che hai tracciato Ŕ esattamente quello che ho visto succedere quando ho fatto uno studio di attivitÓ enzimatica. dopo un certo periodo di tempo l'andamento dell'assorbanza devia da V max.
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Gr÷n
Utente Junior



220 Messaggi

Inserito il - 20 novembre 2012 : 22:31:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gr÷n Invia a Gr÷n un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao e grazie davvero dell'attenzione!

_

Uhm, se si parla di cinetica di M.M. classica, non tirerei affatto modulazioni allosteriche in ballo, tanto pi¨ che la curva del mio esempio non Ŕ nemmeno lontanamente sigmoide.

Qui il vero contributo al decremento di velocitÓ Ŕ dato "solo" dalla saturazione dell'enzima (e come dici tu, dalla progressiva "non dipendenza" della velocitÓ dalla concentrazione di substrato, il che comporta uno shift da una cinetica di prim'ordine ad una di ordine sempre pi¨ prossimo allo zero, almeno relativamente al substrato).

Quello che vi propongo Ŕ il caso pi¨ semplice che si possa immaginare. Niente allosterismo!

_

Solo, mi resta questo dubbio concettuale:

Citazione:
dopo un certo periodo di tempo l'andamento dell'assorbanza devia da V max.


..A parte il fatto che la vMax nel grafico assorbanza/tempo non c'Ŕ (Ŕ un parallelo concettuale che facciamo noi con il grafico di M.M.) - ma perchÚ c'Ŕ questa deviazione "in discesa", se il prodotto colorato che si Ŕ formato non viene sottratto alla soluzione?

CioŔ, lo spettrofotometro non tiene conto del tempo, siamo noi che contiamo i secondi.. Se un sistema ha una tot. concentrazione di prodotto colorato, dovrebbe avere un tot. valore di assorbanza che si stabilizza pi¨ o meno, no?
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AntonioSillo
Nuovo Arrivato



61 Messaggi

Inserito il - 20 novembre 2012 : 23:20:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AntonioSillo Invia a AntonioSillo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ŕ probabile che la deviazione da quel valore di assorbanza sia dovuto ad una degradazione del substrato colorato da parte dell'enzima.
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Gr÷n
Utente Junior



220 Messaggi

Inserito il - 25 novembre 2012 : 15:20:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gr÷n Invia a Gr÷n un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mmh, si, probabilmente sarÓ cosý.

O forse, pu˛ darsi che il prodotto colorato dopo un tot. tempo degeneri. Mah!

Ad ogni modo grazie della partecipazione! =)
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AntonioSillo
Nuovo Arrivato



61 Messaggi

Inserito il - 25 novembre 2012 : 15:32:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AntonioSillo Invia a AntonioSillo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Figurati :)
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