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 Western Blot: componenti del tampone di lisi
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masna
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chromosome


74 Messaggi

Inserito il - 13 novembre 2012 : 21:57:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di masna Invia a masna un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buona sera a tutti, sto studiando un articolo da pubmed, e vorrei dei chiarimenti sui vari composti che sono stati utilizzati nella soluzione di lisi per il western blot.
La tecnica chiaramente la conosco, però certe cose non mi sono chiarissime.

Allora, il pezzo è questo "For EZH2 detection, cells were lyzed in ice cold tris
(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (TRIS-HCl,
50 mM, pH 8,0; Carl Roth) containing 150 mM NaCl (J.T.
Baker, Deventer, Netherlands), 1% Nondiet P-40 (Genaxxon
Bioscience, Ulm, Germany), 10 mM Ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) (GerbuBiotechnik, Gaiberg, Germany), 200 mM
dithiothreitol (Carl Roth), 100 mM phenylmethylsulphonyl fluo-
ride (PMSF) and complete EDTA-free (1:50, Roche, Mannheim
Germany) for 20 min and then centrifuged for 10 min (4uC, 13
000 rpm). For H3K27me3 Western Blot, cells were lysed in ice-
cold RIPA-Buffer (50 mM TRIS-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl,
5 mM EDTA, 1% Triton-X 100, 1% Sodium deoxycholate (both
AppliChem GmbH, Darmstadt. Germany), 100 mM PMSF and
complete EDTA-Free (1:50) for 20 min, sonicated and then
centrifuged for 10 min (4uC, 13 000 rpm). "


Vediamo un po' se ho capito bene:

TRIS-HCl: è semplicemente un tampone, che mantiene il ph entro il range fisiologico, per evitare denaturazione e precipitazione delle proteine

Nonidet P-40: è un detergente per lisare la membrana

EDTA: so che è un chelante, e che può funzionare da inibitore delle metallo-proteasi. suppongo quindi che venga usato appunto per il suo ruolo di inibitore delle metalloproteasi, oppure mi sfugge qualcosa?

DDT: ha lo stesso ruolo di agenti come il 2-mercaptoetanolo, ovvero riduce i ponti disolfuro agevolando la denaturazione

PMSF: è un inibitore delle proteasi
non capisco la dicitura "complete EDTA free"...
se ce l'abbiamo già messo l'EDTA cosa importa che il PMSF sia EDTA-free? E' semplicemente la dicitura commerciale?

Passando a ciò che compare nel secondo tampone di lisi

Triton-X 100: è un tensioattivo
Sodium deoxycholate: anche questo è un tensioattivo

Già che ci sono, cerco anche di chiarirmi altri dubbi che sono sorti procedendo nella lettura dell'articolo

The proteins were separated by
10% (anti-EZH2 Western Blots) or 15% (anti-H3K27me3
Western Blot) sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. Pro-
teins were transferred onto a nitrocellulose membrane (Whatman,
Dassel, Germany) at 1.5 mA/cm2 for 1 h 20 min (EZH2 Western
Blot) or onto polyvinylidene fluoride membrane (PVDF, Millipore,
Temecula, CA, USA) for 45 min (H3K27me3 Western Blot). After
1 h blocking in tris-based saline (TBS) supplemented with 0.1%
Tween 20 (Sigma-Aldrich) and 5% milk powder (Carl Roth), the
membranes were incubated with monoclonal mouse anti-EZH2

Nella fase di blocking, usiamo

TBS: tampone
Tween 20: un surfattante
Milk powder

Se non ho capito male, il Tween 20 e il Milk powder, dovrebbe evitare un'interazione aspecifica degli antircorpi, però non capisco quale sia il principio alla base del loro funzionamento...


Mi scuso per il post molto lungo, e ringrazio anticipatamente chiunque voglia rispondere


masna
Nuovo Arrivato

chromosome



74 Messaggi

Inserito il - 13 novembre 2012 : 22:08:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di masna Invia a masna un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Già che ci siamo, chiedo anche chiarimenti sulla parte finale.


the
membranes were incubated with monoclonal mouse anti-EZH2
(1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, USA), polyclonal
rabbit anti- trimethylation of histone H3 lysine27 (H3K27me3)
(1:2000, Millipore) or with monoclonal mouse anti-a-tubulin
(1:5000, Sigma–Aldrich) overnight at 4uC. Staining with second-
ary horseradish peroxidase conjugated anti-mouse or anti-rabbit
antibody at dilutions of 1:5000 (both GE Healthcare, Buck-
inghamshire, UK) was followed by immunodetection with ECL
Plus reagent (GE Healthcare).


In pratica noi mettiamo gli anticorpi primari, e dopo gli anticorpi secondari coniugati con l'HRP.
Per la rivelazione, usiamo un ECL, che sviluppa fluorescenza quando viene ridotto dall'HRP.

Corretto?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 13 novembre 2012 : 22:43:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
"complete" è il nome di un cocktail di inibitori delle proteasi prodotto dalla Roche (è uno dei più utilizzati)

Il latte serve per bloccare i siti liberi presenti sulla membrana (ci dovrebbe essere una discussione in proposito)

L'ECL non sviluppa fluorescenza ma chemioluminescenza! Contiene luminolo che è il substrato per l'enzima (HRP) e acqua ossigenata, a segiuto della reazione il luminolo viene ossidato (non ridotto) e si sviluppa chemioluminescenza.

Per il restomi sembra corretto, se non mi è sfuggito altro!
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masna
Nuovo Arrivato

chromosome



74 Messaggi

Inserito il - 13 novembre 2012 : 23:44:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di masna Invia a masna un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille, gentilissima come sempre!
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