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cesca81
Nuovo Arrivato



8 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2007 : 14:37:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cesca81 Invia a cesca81 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti!
devo fare un'estrazione di proteine di membrana da colture cellulari (CHO) e un'estrazione di proteine contenute nel mezzo.Potete darmi qualche consiglio?

Black Mamba
Nuovo Arrivato


Città: Roma


24 Messaggi

Inserito il - 01 febbraio 2007 : 17:12:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Black Mamba Invia a Black Mamba un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io generalmente procedo così:
dalle fiasche screpi le cellule,dopo averle raccolte e centrifugate
le devi sonicare.
dopo averle sonicate potrai vedere un tipico flocculo bianco che corrisponde ai debries ovvero ai dedriti degli acidi nucleici che con la sonicazione si sono aggregati.
il supernatante corrisponde alle tue proteine di membrana e le puoi prelevare con la gilson facendo attenzione a nn prendere il flocculino bianco.
procedi poi con lettura proteine con metodo Bradford o lowry come preferisci.
Non so se t sono stata d'aiuto in qualke modo.
spero di sì
Black Mamba!!!!
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 02 febbraio 2007 : 14:14:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao! io in genere uso un buffer di lisi che è il RIPA buffer specifico per le mie cellule (CaCo2) quando devo estrarre le proteine del citosol ed un altro buffer di lisi che invece uso per estrarre le proteine di membrana.
questo secondo buffer lo trovi nella sezione protocolli di biologia cellulare (si chiama SDS extraction buffer).
in genere con questo buffer sono riuscita ad ottenere una bella quantità di proteine di membrana.
per quanto riguarda invece le proteine del citosol, io uso il RIPA perchè è quello consigliato sul data sheet delle mie cellule; se anche tu hai un data sheet per le CHO ti dovrebbe indicare il miglior buffer di lisi testato su queste cellule.
una volta che ho lisato le proteine col RIPA, faccio centrifugare ed ottendo il pellet. lo recupero e lo tratto con SDS buffer (in genere mi calcolo il V di pellet ed aggiungo un volume 3 volte superiore di SDS buffer), usando un piccolo potter (purtroppo non ho il sonicatore) e cercando di rompere quanto più possibile, e poi faccio bollire i campioni per almeno mezz'ora, agitando spesso. in questo modo riesco a far sciogliere le membrane e ad ottenere le proteine. poi procedo come se fosse una normale estrazione proteica.
fammi sapere se ti basta come risposta o vuoi qualche altra puntualizzazione.
un bacio

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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cesca81
Nuovo Arrivato



8 Messaggi

Inserito il - 05 febbraio 2007 : 18:01:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cesca81 Invia a cesca81 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie tante,in settimana mi metterò a fare l'estrazione e vi saprò ridire...Ciao!!
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Sonia82
Nuovo Arrivato


Città: Modena


2 Messaggi

Inserito il - 06 febbraio 2007 : 11:01:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Sonia82 Invia a Sonia82 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti!
scusa Iside, ma che significa procedi poi come una normale estrazione proteica? dopo aver bollito il campione prelevo solo il sup proteico?
scusa l'ignoranza ma non ho molta esperienza in merito e anch'io devo estrarre un proteina di membrana...

Sonia
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 08 febbraio 2007 : 23:16:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao SONIA,
sì, procedo come una normale estrazione nel senso che dopo aver fatto bollire e aver centrifugato raccolgo il sovratante e lo diluisco 1:1 in Laemli sample buffer. considera che avrai volumi minimi, in genere io non riesco ad ottenere più di 30 microlitri, ma cmq sono sufficienti per fare la corsa.
se hai ancora bisogno chiedi pure...il mio mondo è una camera oscura!!!
baci.

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Sonia82
Nuovo Arrivato


Città: Modena


2 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2007 : 16:05:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Sonia82 Invia a Sonia82 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille! sei stata veramente molto gentile, ti saprò dire!

Sonia
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illy88
Nuovo Arrivato



46 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2020 : 10:08:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di illy88 Invia a illy88 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scritto da MolecularLab Mobile

Salve a tutti,so che questo post è di svariati anni fa ma spero possiate aiutarmi,devo fare anche io un estrazione di proteine del citosol e di membrana e ho provato vari protocolli senza successo!vorrei provare il protocollo di Iside ma ho un dubbio: dopo aver estratto le proteine del citosol aggiungo al pellet l'SDS buffer e rompo (io in genere uso una siringa da insulina) poi metto i campioni a 100gradi in agitazione per 30 min... Ma in questo modo non degrado troppo le proteine?
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 26 luglio 2020 : 20:02:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il Laemli sample buffer va aggiunto prima di bollire i campioni, così denatura le proteine e inibisce la degradazione

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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