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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato

GH


25 Messaggi

Inserito il - 11 dicembre 2012 : 16:47:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GiuliaHermione Invia a GiuliaHermione un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti
Avrei bisogno d aiuto...
Devo fare una ligation e non so da che parte rifarmi, visto che le variabili sono molte..
Il mio inserto "pesa" 273 bp mentre il vettore è 5364 bp (già digeriti con enzimi di restrizione). Estremità coesive e non compatibili.
La ligasi che ho acquistato è della Invitrogen (https://products.invitrogen.com/ivgn/product/15224017?ICID=search-product). Vi allego anche il bollettino tecnico.

Non ho mai fatto niente del genere e sono veramente, VERAMENTE ignorante al massimo in materia.
Mi date qualche consiglio?

Una volta effettuata la ligation, lo step di verifica è il gel di agarosio?
Grazie davvero
G





Allegato: 711-011109 TB T4 DNA Ligase (1).pdf
132,16 KB

Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 11 dicembre 2012 : 19:37:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dalle tue domande sembra che ti abbiano presa e buttata di forza in un lab in cui non ci sia un leader un collega un qualcuno con almeno 6 mesi di esperienza nel lab che ti possa seguire


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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato

GH



25 Messaggi

Inserito il - 11 dicembre 2012 : 20:26:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GiuliaHermione Invia a GiuliaHermione un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Esatto..
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Scrambled
Nuovo Arrivato

overlay



21 Messaggi

Inserito il - 11 dicembre 2012 : 21:41:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Scrambled Invia a Scrambled un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao, ma devi fare un clonaggio?
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Scrambled
Nuovo Arrivato

overlay



21 Messaggi

Inserito il - 11 dicembre 2012 : 22:41:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Scrambled Invia a Scrambled un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io non ho mai fatto clonaggi, ma reminescenze di studi non ricordo della verifica della ligazione...in teoria(se non mi sbaglio) trasformi e poi verifichi l'inserzione mediante selezione, non so, tipo alcuni plasmidi hanno una resistenza ad un farmaco(mi sembra triptofano) che si attiva solo se un'altro gene presente sul plasmide viene interrotto, in questo caso dal tuo inserto.
boh spero di esserti stata utile
buona serata
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 11 dicembre 2012 : 23:03:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Giulia,
ci sono molte discussioni sull'argomento, prova a cercare in quelle gia' pubblicate e se poi hai ancora dubbi ri-scrivi. La verifica piu' semplice comunque e' la trasformazione, niente corse su gel...

@Scrambled: il triptofano un farmaco? Booouuuuummmmmm

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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato

GH



25 Messaggi

Inserito il - 12 dicembre 2012 : 09:19:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GiuliaHermione Invia a GiuliaHermione un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie Spemann, avevo già dato un'occhiata, ora guarderò + approfonditamente.Ho scritto da capo solo per sapere se secondo voi si trattava di un caso "standard" come lunghezze dei frammenti e se qualcuno aveva usato la ligasi T4 della invitrogen.
Grazie anche a Scrambled per la risposta.

Vi farò sapere. Intanto proverò le condizioni standard e chiederò aiuto a un ragazzo di un altro gruppo.


PS: Patrizio quando ho letto la tua risposta m è presa male xche è proprio così, sono l'unica che fa qst cose nel mio gruppo, e anche in tutto il dipartimento...le mie risorse sono Google e Youtube quindi son messa maluccio! Più che altro mi sento proprio scarsa, a perdermi in queste cose che sono le basi...ma non le ho mai fatte...se non sui libri! Se penso che le fanno in tesi triennale, mentre io sono alla fine del 1° anno di PhD...


Scusate lo sfogo!
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato

GH



25 Messaggi

Inserito il - 12 dicembre 2012 : 09:42:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GiuliaHermione Invia a GiuliaHermione un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusate, vi chiedo un paio cosine e non vi tormento più...

1) temperatura e tempo di incubazione: consigliano 22-26°C per 1h... che dite, se lascio ON è meglio?
2) quantità di DNA: se calcolo 10 fmol di vettore e 30 di inserto, ottengo circa 18 ng e circa 3 ng, rispettivamente. Sono pochi secondo voi?
3) trasformazione: come faccio a calcolare la quantità di soluzione da usare? Do per scontato che la quantità di plasmide ottenuta sia pari al DNA totale usato?
4) per inattivare l'enzima, meglio usare l'EDTA o l'incubazione a 70°C?

GRAZIE GRAZIE GRAZIE!!!!!!!!!!!!
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 12 dicembre 2012 : 14:55:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
1) per adesso attieniti al protocollo, i casi in cui ho fatto ligazioni on la temperatura prescelta è stata di 14-16°C anziché RT;
2) pochissimi direi, credo serva un microgrammo di DNA per l'inserto. Per avere un'idea delle proporzioni tra vettore ed inserto carico su gel un uguale volume per i due e a fine corsa visualizzo l'intensità delle bande. Se vedo che intensità banda inserto/intensità banda vettore = 1/6, per dire, e desidero un rapporto di 3:1 inserto-vettore per la mia ligazione, so che dovro' ricorrere a 18 volte più inserto (rispetto al vettore);
3) per 50 uL di DH5alpha aggiungo tra 1 e 5 uL di prodotto di ligazione, a seconda dell'efficienza che mi aspetto. Talvolta effettuo più trasformazioni con il medesimo prodotto di ligazione;
4) mai inattivata la ligasi, a ligazione conclusa passo alla trasformazione direttamente e l'aliquota restante viene conservata a -20°C, dove l'attività dell'enzima dovrebbe tendere a zero.

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 12 dicembre 2012 : 18:20:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io faccio avvenire la ligation O/N a 4°C.
Per quanto riguarda le quantità, non supero mai i 100 ng totali, in modo da non inibire l'attività enzimatica. In pratica aggiungo dai 30 ai 50 ng di vettore e l'inserto in base al rapporto molare scelto.
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Scrambled
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overlay



21 Messaggi

Inserito il - 12 dicembre 2012 : 18:39:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Scrambled Invia a Scrambled un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ahahha oddio cosa avevo scritto..ovviamente intendevo resistenza a terreni selettivi....

in bocca al lupo Giulia!
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato

GH



25 Messaggi

Inserito il - 13 dicembre 2012 : 09:47:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GiuliaHermione Invia a GiuliaHermione un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille a tutti per i preziosi consigli!!!
@roberta: la ligasi che usi è quella della Invitrogen?
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