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Anuba
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4 Messaggi

Inserito il - 15 dicembre 2012 : 21:25:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Anuba Invia a Anuba un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buonasera a tutti.. mi sono appena iscritta.. mi è stato descritto questo forum come molto utile per ogni dubbio o problematica nell'ambito "biologico" :) in quanto le persone presenti sono molto competenti.. :D e allora proprio per questo spero di trovare qui un aiuto..
dovrei eseguire un elettroforesi per vedere se ha avuto buon esito l'estrazione di RNA da tessuto animale che ho effettuato.. non avendo mai fatto un'elettroforesi per RNA, volevo avere qualke consiglio e se possibile proprio il protocollo da seguire.. :) grazie mille in anticipo

Scrambled
Nuovo Arrivato

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21 Messaggi

Inserito il - 16 dicembre 2012 : 16:29:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Scrambled Invia a Scrambled un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao, ti spiego come lo faccio io.
innanzitutto lavo tutto con sds al 2%,
uso gel agarosio al 3% e carico 1microl di Rna con circa un 1microl di colorante(0,25 % blu di bromofenolo-0,25% xilencianolo e glicerolo 30% in acqua)e faccio correre 10-15 minuti, come una normale corsa di dna.

spero di esserti stata d'aiuto.
ciao
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 16 dicembre 2012 : 22:42:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scrambled credo che manchi un aldeide come glioxal o formaldeide per denaturare.
Io non ho sottomano il protocollo che usavo ma sembra che manchi qualcosa, inoltre dovresti dire la concentrazione dell'RNA


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Anuba
Nuovo Arrivato



4 Messaggi

Inserito il - 16 dicembre 2012 : 23:19:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Anuba Invia a Anuba un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
la concentrazione nn la so ancora.. in quanto mi è stato kiesto di farlo correre direttamente.. per vedere se l'estrazione è riuscita.. :/


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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 17 dicembre 2012 : 00:43:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Anuba

la concentrazione nn la so ancora.. in quanto mi è stato kiesto di farlo correre direttamente.. per vedere se l'estrazione è riuscita.. :/






mi riferivo a scrambled :)


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Scrambled
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21 Messaggi

Inserito il - 17 dicembre 2012 : 17:48:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Scrambled Invia a Scrambled un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao patrizio ovviamente il gel di agarosio lo preparo al 3% in 100ml di TAE 1X.
la concentrazione e la purezza la calcolo con il NanoDrop, ma poco mi importa perchè lo faccio correre anche senza sapere la concentrazione (estraggo RNA da pellett di fibro con il kit Qiagen), e lo faccio correre per sapere se è integro e mi vado a vedere le due bande del RNA ribosomiale.

anuba io faccio il gel come scritto sopra, se vuoi ti do il protocollo anche per fare il TAE 1X,a cui aggiungo 100microlitri di bromuro di etidio (diluito 1:2000 da una soluzione di partenza di 0,07% di peso/volume)
ovviamente il TAE 1X è anche come soluzione nella cameretta da corsa (non mi viene in mente il nome).
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 17 dicembre 2012 : 18:33:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
@Scrambled: Patrizio ti chiedeva la concentrazione dell'RNA non del gel!
Poi l'altra cosa che diceva è che in genere si usa un gel denaturante.

Comunque visto che mi pare che in questa discussione si stia facendo un po' di confusione e non vi state intendendo molto provo a fare un po' di chiarezza, magari anche ad altri potrà essere utile.

L'RNA tende a formare strutture secondarie, quindi in genere si fa una elettroforesi in condizioni denaturanti in modo che sia linearizzato, solo in queste condizioni l'RNA migrerà in base al log10 del suo peso molecolare e si potrà determinarne esattamente la grandezza.
Questo è "fondamentale" quando si fa un Northern Blot, se si tratta invece solo di vedere l'integrità dell'RNA estratto si può far migrare anche l'RNA in un gel non-denaturante perché quello che si vuole vedere è semplicemente la presenza delle bande di rRNA che sono le più intense e verificare che queste siano integre.

(detto in parole spicce: fare un gel denaturante per RNA è un po' una menata, per controllare l'integrità dell'RNA si usa spesso quello non denaturante che è molto più semplice!)

Detto questo ecco due protocolli per i due tipi di Gel:


Gel di Agarosio Denaturante

Reagenti:
10 x MOPS buffer:
0.2M MOPS (morpholinopropanesulphonic acid)
50mM sodio acetato
10mM EDTA
Aggiustare a pH 7.0 con 1M NaOH e autoclavare

Sample Buffer denaturante per RNA:
50% formamide deionizzata
2.2 M formaldeide
1x MOPS buffer

10x gel loading dye:
50% glicerolo
10 mM EDTA, pH8
0.25% blue di bromofenolo
0.25% xylene cianolo

Preparazione del gel di Agarosio 1%
Per 100ml
Agarosio 1 g
Acqua distillata 72 ml
MOPS 10x 10 ml
Formaldeide 12.3M (37%) 18 ml (Conc. finale 2.2M)

Sciogliere l’agarosio in acqua distillata, una volta raggiunta la temperatura di circa 60°C aggiungere formaldeide e MOPS 10x.

Preparazione dei campioni per la semina del gel
Mettere 2ul di RNA (1-3 ug fino ad un massimo di 20ug) in 18ul di buffer denaturante e appena prima di seminare denaturare i campioni a 65°C per circa 10min, raffreddare in ghiaccio e aggiungere 2ul di gel loading dye con Etidio.
Loading dye con Etidio: diluire l’EtBr 10mg/ml 1:100 nel Loading dye 10x (concentrazione finale di 100 ug/ml)

Elettroforesi in MOPS 1x (si può aggiungere anche 2.2M formaldeide)
Far migrare lentamente, in genere 5V/cm fino a che il colorante non ha raggiunto 2/3 del gel.

(N.B. se il gel è solo per vedere l'integrità dell'RNA in realtà si può anche far migrare un po' più veloce)


Gel di Agarosio non denaturante

TAE Buffer 10x
48.4 g di Tris base [tris(hydroxymethyl)aminomethane]
11.4 mL di acido acetico glaciale (17.4 M)
3.7 g di EDTA (o 20ml EDTA 0.5M)
Sciogliere in 800ml di acqua deionizzata e una volta sciolto portare a volume di 1L.

Preparare un gel di Agarosio 1-1,2% in TBE 1x e prima di versare aggiungere l’etidio ad una concentrazione finale di 0.5ug/ml.
Utilizzare 2-5ul di RNA.
Prima di seminare denaturare i campioni di RNA a 70°C for 1 min e poi metterli subito in ghiaccio, aggiungere il loading dye e seminare i campioni.
Elettroforesi in TAE 1X a 10 V/cm.
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Scrambled
Nuovo Arrivato

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21 Messaggi

Inserito il - 17 dicembre 2012 : 19:22:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Scrambled Invia a Scrambled un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
brava GFPina, direi che è decisamente più chiaro così!
comunque chiedo scusa se non ho capito un tubo (mi si incrociano gli occhi e mi sa anche i neuroni ) alla fine quello che volevo dire è che non interessa la concentrazione dell'RNA o l'utilizzo di un gel denaturante se si deve verificare l'integrità dell'RNA, che penso fosse quello che servisse ad anuba.

un saluto a tutti e buon lavoro
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