Forum

Nome Utente:
Password:
Riconoscimi automaticamente
 Tutti i Forum
 Laboratorio
 Tecniche
 SOLiD Sequencing
 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
I seguenti utenti stanno leggendo questo Forum Qui c'è:

Aggiungi Tag Aggiungi i tag

Quanto è utile/interessante questa discussione:

Autore Discussione  

Geeko
Utente

Ctenophor1.0
Città: Milano


1043 Messaggi

Inserito il - 29 dicembre 2012 : 16:13:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sto studiando le principali tecniche next generation sequencing e con poca sorpresa quello più cervellotico è il metodo SOLiD.
In questo metodo il sequenziamento avviene per ligazione. Si usano degli oligonucleotidi parzialmente degeneri marcati in modo fluorescente con un fluorocromo diverso in base al dinucleotide specifico che portano ("di-base probes").
Esistono un totale di 16 possibili combinazioni di dinucleotidi usando le 4 basi e questi dinucleotidi sono suddivisi in 4 pool, ciascuno associato ad un diverso fluorocromo.
La lettura avviene ciclo per ciclo in base al colore emesso dalla "di-base probe" appena incorporata e ligata.

Una cosa in particolare non mi è chiara: per ciascun step di ligazione quanti di-nucleotidi (o meglio, di-base probes) vengono aggiunti da ogni pool dello stesso colore? Uno, o tutti e quattro?

La tecnica è complessa e non l'ho descritta tutta, ma se servisse butto giù gli step che ci sono dietro. Magari sarà utile a qualcuno in futuro.


Selenocisteina
Nuovo Arrivato

lucy



64 Messaggi

Inserito il - 30 dicembre 2012 : 19:39:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Selenocisteina Invia a Selenocisteina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao, potrei dire qualche cavolata perché sono cose che ho studiato un annetto fa e forse non ho capito bene la domanda :P

Non saprei dirti con certezza (i.e. con una fonte precisa) l'esatta risposta alla tua domanda, ma da quanto mi ricordo il problema del 2-base encoding è proprio che nessun colore identifica univocamente una base, quindi immagino che i probe per ogni fluoroforo vengano aggiunti tutti assieme (se no basterebbe sapere quale probe hai messo...).

Da quanto ricordo, ci sono infatti due modi per "decodificare" le letture solid:
- quando si fa de novo sequencing, anche se questo non avviene quasi mai perché i read sono troppo corti per fare assemblaggio, se non sbaglio si sequenzia anche la prima base del primer (o comunque si fa in modo di avere una base nota all'inizio o alla fine del read). Se tu conosci la prima base, puoi decodificare il codice a 2 basi in modo univoco (è fatto apposta). Qui c'è una sorta di fonte su questo punto http://en.wikipedia.org/wiki/2_base_encoding.

- quando si fa resequencing, applicazione più comune perché solid è usato principalmente per SNP analysis e cose così, si mappano direttamente le coppie colorate su un genoma di riferimento che è stato convertito in "coppie colorate" (spiegato così è incomprensibile, qui http://appliedbiosystems.cnpg.com/Video/flatFiles/699/slides.swf trovi la spiegazione decente ), e da lì si risale alla sequenza.

Torna all'inizio della Pagina

Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1043 Messaggi

Inserito il - 30 dicembre 2012 : 19:54:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si, ecco non capivo come si potesse decodificare il "color-code" aggiungendo contemporaneamente alla reazione tutte quattro le probes da ogni pool di colore diverso. Il colore in sé infatti non mi dice niente su quale base ho di fronte (quale delle 4 probes si è ibridata).
D'altra parte avrebbe poco senso usare una sola probe (cioè un solo di-nucleotide specifico) da ognuno dei quattro pool perché praticamente non sequenzierei nulla non appena capita un dinucleotide non riconosciuto da nessuna delle probes usate.
Conoscendo però la prima base tutto si sblocca. Grazie mille!

Se mi vengono altri dubbi so a chi chiedere :P


Torna all'inizio della Pagina

Selenocisteina
Nuovo Arrivato

lucy



64 Messaggi

Inserito il - 30 dicembre 2012 : 20:25:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Selenocisteina Invia a Selenocisteina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Prego non c'è di che :) se hai altri dubbi io sono qui! (sempre che sappia rispondere :P)

http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=10
Ecco, qui dicono sempre la stessa cosa che dicevo prima: si sequenzia L'ULTIMA (e non la prima, come ho scritto prima per sbaglio :D) base dell'adattatore! C'è anche una figura, però bisogna essere iscritti per visualizzarla.

Infatti, hai ragione sul fatto dell'usare i probe separatamente: più che altro, penso ci vorrebbe troppo tempo a farli tutti 16 uno alla volta e poi ripetere il ciclo ogni volta...

[edit] La figura è sicuramente questa http://www.appliedbiosystems.com/etc/medialib/appliedbio-media-library/images/application-and-technology/solid-next-generation-sequencing/data-images.Par.73223.Image.850.312.1.gif.ssc_data_fig5_sm_jpg.gif , infatti qui si vede che quando il sequencing primer è accorciato a n-1 viene sequenziata la base 0, che fa parte dell'adattatore.
Torna all'inizio della Pagina

Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1043 Messaggi

Inserito il - 30 dicembre 2012 : 21:10:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Quella figura l'avrò vista una marea di volte e mi sono accorto che veniva sequenziata anche l'ultima base dell'adattatore solo dopo che me l'hai fatto notare nel primo post XD
Tutto chiaro ora.


Torna all'inizio della Pagina
  Discussione  

Quanto è utile/interessante questa discussione:

 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
Vai a:
MolecularLab.it © 2003-18 MolecularLab.it Torna all'inizio della Pagina