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Inserito il - 12 gennaio 2013 : 21:34:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 283 Invia a 283 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti... provo a chiedervi un consiglio..
ho analizzato vari geni per trovare il mio housekeeping e ho già letto tutto ciò che c'è gà nel forum.. ho trovato 3 hk che si mantengono stabili nei campioni e non variano. ho letto in una discussione che si diceva che nn ha molta importanza il Ct a cui esce l'hk.. però mi chiedevo se possa essere corretto usare un hk che esce praticamente allo stesso ciclo del mio gene di interesse.. non solo ma analizzando i dati per tutti con gli hk ottengo risultati diversi..

cosa ne pensate?
sarei davvero grata per qualsiasi risposta perchè davvero non so più che fare.

GFPina
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GFPina

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Inserito il - 13 gennaio 2013 : 14:10:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
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.. però mi chiedevo se possa essere corretto usare un hk che esce praticamente allo stesso ciclo del mio gene di interesse..

Sì, anzi è anche meglio!

Citazione:
Messaggio inserito da 283

...non solo ma analizzando i dati per tutti con gli hk ottengo risultati diversi..

non capisco cosa tu voglia dire!

Hai detto che ha prima analizzato gli housekeeping e visto che sono stabili nei campioni, quindi solo in tuo GOI deve variare, normalizzando con ognuno dei tre HK o con tutti e tre assieme dovresti ottenere lo stesso risultato.
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283
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Inserito il - 13 gennaio 2013 : 15:07:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 283 Invia a 283 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
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Messaggio inserito da GFPina

Citazione:
Messaggio inserito da 283

.. però mi chiedevo se possa essere corretto usare un hk che esce praticamente allo stesso ciclo del mio gene di interesse..

Sì, anzi è anche meglio!

Citazione:
Messaggio inserito da 283

...non solo ma analizzando i dati per tutti con gli hk ottengo risultati diversi..

non capisco cosa tu voglia dire!

Hai detto che ha prima analizzato gli housekeeping e visto che sono stabili nei campioni, quindi solo in tuo GOI deve variare, normalizzando con ognuno dei tre HK o con tutti e tre assieme dovresti ottenere lo stesso risultato.



intendo dire che ho usato come hk:HPRT, UbC che escono allo stesso ciclo del mio gene,e B2M che invece esce 7 cicli prima. ciò che non capisco è che con B2M ottengo risulatati di espressione con significato diverso.. ovvero l'espressione del gene è ridotta mentre con gli hk era aumentata.

invece cosa intendi per usare tutti e tre assieme gli hk?
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GFPina
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GFPina

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Inserito il - 13 gennaio 2013 : 17:47:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Evidentemente hai sbagliato a scegliere gli HK, non è vero come dici all'inizio che sono stabili!
Se normalizzi un HK rispetto ad un altro, ad es. HK1 rispetto a HK2 devi ottenere lo stesso valore i tutti i campioni altrimenti non è stabile! Se provi ad es. a normalizzare la tua B2m rispetto a HPRT molto probabilmente otterrai valori diversi nei tuoi campioni.

Utilizzarli tutti e tre insieme significa "usarli tutti e tre":
GOI/(HK1,HK2,HK3)
in genere i programmi di analisi ti consentono di farlo.
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283
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Inserito il - 13 gennaio 2013 : 17:57:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 283 Invia a 283 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
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Messaggio inserito da GFPina

Evidentemente hai sbagliato a scegliere gli HK, non è vero come dici all'inizio che sono stabili!
Se normalizzi un HK rispetto ad un altro, ad es. HK1 rispetto a HK2 devi ottenere lo stesso valore i tutti i campioni altrimenti non è stabile! Se provi ad es. a normalizzare la tua B2m rispetto a HPRT molto probabilmente otterrai valori diversi nei tuoi campioni.




innanzittutto grazie per la risposta.
per stabili intendo che al massimo può essere che ci siano uno o due campioni con un ciclo di differenza ma tutti gli altri escono a valori vicinissimi: 24,5-23.8-24.9 per es.

per l'analisi utilizzo il metodo del delta delta Ct.
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GFPina
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GFPina

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Inserito il - 13 gennaio 2013 : 18:07:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Quello non significa affatto che sono stabili!
Dato che hai detto che hai letto tutte le discussioni in proposito, dovresti aver letto anche quelle dove spiego come scelgiere gli HK, è spiegato tutto.
Tu dici che hai al massimo un ciclio soglia di differenza, ok ma considerando solo un HK alla volta.
Se ad es. nel campione nº2 rispetto al campione nº1 hai per l'HK1 un aumento di un Ct e per l'HK2 invece una diminuzione di un Ct c'è una bella differenza! Non puoi dire che sono entrambi stabili!
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283
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Inserito il - 13 gennaio 2013 : 18:11:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 283 Invia a 283 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
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Messaggio inserito da GFPina

Quello non significa affatto che sono stabili!
Dato che hai detto che hai letto tutte le discussioni in proposito, dovresti aver letto anche quelle dove spiego come scelgiere gli HK, è spiegato tutto.




si e ho letto che indichi di usare programmi come normfinder o genorm.
ma è solo questo il metodo? usare questi programmi per trovare l'hk giusto? perchè ciò che allora non capisco è che cosa vuol dire che l'hk va bene per me.. in letteratura di solito leggo che non esiste un hk ideale.
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GFPina
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GFPina

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Inserito il - 14 gennaio 2013 : 16:09:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non esiste un HK ideale perché qualunque gene è sottoposto a controllo e può essere più o meno espresso. Per ogni caso bisogna trovare l'HK o meglio gli HK più adeguati che siano "stabili" in tutte le condizioni sperimentali considerate. Puoi anche trovare l'HK "perfetto" (anche se perfetto non sarà mai) nelle tue condizioni sperimentali, ma se poi cambi condizioni sperimentali quell'HK può non essere più ideale.

Utilizzare i programmi per determinare qual è l'HK migliore è la cosa più semplice, ma volendo puoi benissimo fare i conti a mano!
I conti da fare, o meglio quelli usati da GeNorm, sono questi:


(referenza: http://genomebiology.com/2002/3/7/research/0034/)

Se vuoi puoi anche fare i calcoli usati da BestKeeper, ma sono ben più complicati!

In ogni caso come ti dicevo anche prima per avere un'idea devi fare un rapporto:
HK1/HK2... ecc... e vedere che rimanga stabile, se il rapporto non è stabile l'HK non è adeguato.

Poi una volta trovati gli HK stabili la quantificazione del tuo gene la davi fare con "tutti" gli HK, quindi al posto di fare GOI/HK devi fare GOI/(media HK)
come media è meglio usare la media geometrica piuttosto che la media aritmetica.
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