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 Inserito il - 16 gennaio 2013 : 13:45:36
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salve ragazzi ho da farvi qualche domanda sull'estrazione del DNA.
La prof ha detto che utilizzando come campione il sangue devo lisare i globul rossi per ottenere i globuli bianchi.Per cui dopo aver aggiunto Edta o eparina come anticoagulante bisogna aggiungere 7 volumidi soluzione ipotonica.In tal modo lisiamo i globuli rossi.ma in questo modo non lisiamo anche quelli bianchi?
poi dice che si deve centrifugare e allontanare il supernatante e aggiungere una soluzione di lisi contenente sale detergente e proteinasi k.ma non avevamo gia lisato le cellule?
DOPO FATTO QUESTO PRENDIAMO il lisato lo trsferiamo in un tubo per un'altra centrifuga e aggiungiamo fenolo/cloroformio.
questo perche si fa?
dopo dice di aggiungere la fase acquosa in deu volumi di etanolo al 100 per cento perche essendo l'etanolo apolare il dna che è polare si riavvolge su se stesso e precipita in etanolo.
qui ho due domande:ma l'etanolo non è polare?e poi cosa vuol dire etanolo al 100 per cento
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funny
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Inserito il - 16 gennaio 2013 : 16:47:28
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un'altra cosa la fase finale prevede il prelievo del flocculo con una pipetta e lo trasferiamo in una soluzione al 70 per cento,centrifugo ancora.perche?non ho gia separato il dna dal resto?
e poi allontano il supernatante e il pellet lo risospendo in una soluzione di tris/edta,cosa è? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2013 : 18:28:50
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Citazione:
In tal modo lisiamo i globuli rossi.ma in questo modo non lisiamo anche quelli bianchi?
No si lisano solo i rossi (che "esplodono") i bianchi rimangono intatti!
Citazione:
poi dice che si deve centrifugare e allontanare il supernatante e aggiungere una soluzione di lisi contenente sale detergente e proteinasi k.ma non avevamo gia lisato le cellule?
No appunto, i bianchi non sono stati lsati!
Citazione:
DOPO FATTO QUESTO PRENDIAMO il lisato lo trsferiamo in un tubo per un'altra centrifuga e aggiungiamo fenolo/cloroformio.
questo perche si fa?
Per separare il DNA che rimarrà dalla fase acquosa, dal resto (proteine) che andrà nella fase organica.
Citazione:
dopo dice di aggiungere la fase acquosa in deu volumi di etanolo al 100 per cento perche essendo l'etanolo apolare il dna che è polare si riavvolge su se stesso e precipita in etanolo.
qui ho due domande:ma l'etanolo non è polare?
No è apolare!
Citazione:
e poi cosa vuol dire etanolo al 100 per cento
tutto etanolo, etanolo puro!
Citazione:
un'altra cosa la fase finale prevede il prelievo del flocculo con una pipetta e lo trasferiamo in una soluzione al 70 per cento,centrifugo ancora.perche?non ho gia separato il dna dal resto?
l'hai separato dal resto, ma l'hai anche precipitato è un "gomitolo" che così com'è non è utilizzabile, lo devi riportare in soluzione e lo fai gradualmente passandolo prima in etanolo al 70% (70% etanolo, 30% acqua) e poi in una soluzione acquosa.
Citazione:
e poi allontano il supernatante e il pellet lo risospendo in una soluzione di tris/edta,cosa è?
Una soluzione acquosa contenente TRIS e EDTA in cui viene sciolto il DNA. |
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funny
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Inserito il - 16 gennaio 2013 : 19:13:51
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| scusa e perche i globuli bianchi non lisano? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2013 : 20:24:24
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Gli eritrociti tendono ad esser più inclini a lisare in una soluzione ipotonica in quanto strutturalmente più fragili: il cortex submembranario non riesce a contrastare il rigonfiamento della cellula determinato dall'influsso di acqua.
E questo è in buona parte dovuto al fatto che l'apparato di biosintesi nell'eritrocita, una cellula praticamente "morta", presenta un'attività quasi nulla e di conseguenza tutti gli insulti strutturali a cui essi vanno incontro nell'arco dei loro 120 giorni di vita non possono venire riparati.
Insomma, usura da mancata manutenzione.
Visto che te ne sei dimenticato (la sete di conoscenza a volte gioca brutti scherzi, nessun problema), ringrazio io GFPina per la bella spiegazione: anche conoscendo già certi particolari è sempre un piacere rinfrescare le proprie nozioni.  |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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funny
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Inserito il - 16 gennaio 2013 : 20:34:20
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ovviamente ringrazio entrambi semplicemente avevo considerato non terminata la conversazione! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2013 : 20:47:56
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No problem, l'avevo già scritto.
Ti torna il discorso globuli rossi vs bianchi? |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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funny
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76 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2013 : 09:41:01
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| si si.l'unica cosa che non mi torna è il fatto che l'etanolo è apolare dato che quell'ossigeno si attrae gli elettroni su di se.e poi puo formare legami con l'acqua per cui secondo me è polare.poi sono andata a controllare dei vecchi appunti di esami precedenti dove c'è scritto che il dna precipita perche l'etanolo e altri ioni liberano del guscio di solvatazione il dna.quindi vuol dire che formano legami con le molecole di acqua.allora mi ritrovo con la mia tesi che l'etanolo è polare.tu che pensi? |
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funny
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76 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2013 : 09:47:51
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ah puoi dare anche un'occhiata al forum di genetica "mutazioni a partire dall'mRNA" e "mappe genetiche"? grazie! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2013 : 16:48:53
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Citazione:
Messaggio inserito da funny
si si.l'unica cosa che non mi torna è il fatto che l'etanolo è apolare dato che quell'ossigeno si attrae gli elettroni su di se.e poi puo formare legami con l'acqua per cui secondo me è polare.poi sono andata a controllare dei vecchi appunti di esami precedenti dove c'è scritto che il dna precipita perche l'etanolo e altri ioni liberano del guscio di solvatazione il dna.quindi vuol dire che formano legami con le molecole di acqua.allora mi ritrovo con la mia tesi che l'etanolo è polare.tu che pensi?
Beh visto che i dubbi mi sembravano tanti e che a lezione vi era stato detto così, non sono stata a farla tanto lunga sulla questione della polarità dell'etanolo per non complicare ulteriormente la cosa.
Comunque, visto che sollevi la questione...
L'etanolo è meno polare dell'acqua, la costante dielettrica dell'acqua è attorno a 80 mentre quella dell'etanolo è attorno a 24. Ci sono poi sostanze apolari come ad es. il benzene che ha una costante dielettrica attorno a 2,3.
Comunque sostanze molto polari come gli acidi nucleici stanno molto bene in soluzione acquosa mentre in etanolo (che è meno polare) tendono a precipitare. In genere poi per aumentare la precipitazione si aggiungono anche dei sali.
Spero questa chiarificazione ti abbia sciolto i dubbi.
P.S. grazie 0barra1 |
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funny
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Inserito il - 18 gennaio 2013 : 09:15:28
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ooooooooook.sei stata molto chiara.grazie!! |
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Estrazione del DNA
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