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 retrotrascrizione con primer specifici
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liciageno
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107 Messaggi

Inserito il - 17 gennaio 2013 : 09:54:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di liciageno Invia a liciageno un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao
Vorrei sapere bene quand' che dovrei fare una retrotrascrizione con primer specifici anzich usare l'oilgodT. Qual il vantaggio? A questo punto visto che vado a retrotrascrivere specificamente la mia regione d'interesse non vantaggioso fare sempre una retratrascrizione di questo genere?
Grazie

luko
Nuovo Arrivato



42 Messaggi

Inserito il - 20 gennaio 2013 : 12:21:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di luko Invia a luko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

allora ci sono sostanzialmente 3 metodi
1) retro trascrizione oligo dt
2) retro trascrizione primer selettivi
3) procedura ONESTEP

il primo si usa come punto di partenza, se la retrotrascizione va a buon fine e l'amplificazione con i tuoi primer selettivi funziona, allora tutto ok puoi anche andare in realtime.

il secodno caso si usa quando il tuo "messaggero selettivo" poco presente. In quel caso vai "tirato" sul tuo messaggero d'interesse e lo retrotrascrivi senza problemi, il problema ke non puoi andare in real time! x in quel caso tu hai amplificato un primer selettivo ed il tuo housekeeping real time rimane fuori e non potresti controllarne l'espressione

il terzo caso (il piu dispendioso) si usa quando la concentrazione del tuo primer molto molto molto molto bassa!!! e ti serve solo a vedere se c'!! Il one step retrotrascrive e aplifica in processo unico. Anche in questo caso ci sono problemi con la realtime, xe in quel caso il tuo campione contiene una taq, e te la porti dietro nella analisi sucessive di rt.

Ora passiamo alla televendita!! il kit di retrotracrizione ke uso io quello della promega, quello della onestep invitrogen superscript III con platinum taq.

Gianluca



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luko
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42 Messaggi

Inserito il - 20 gennaio 2013 : 19:28:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di luko Invia a luko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

ho sbagliato una cosa!!!!!
ehmmmm scusatemi!

allora

il terzo caso (il piu dispendioso) si usa quando la concentrazione del tuo MESSAGGERO (e non primer) molto molto molto molto bassa!!! e ti serve solo a vedere se c'!! Il one step retrotrascrive e amplifica in processo unico. Anche in questo caso ci sono problemi con la realtime, xe in quel caso il tuo campione contiene una taq, e te la porti dietro nella analisi sucessive di rt.
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liciageno
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107 Messaggi

Inserito il - 21 gennaio 2013 : 13:22:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di liciageno Invia a liciageno un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho capito tutto, grazie :)
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GFPina
Moderatore

GFPina

Citt: Milano


8378 Messaggi

Inserito il - 23 gennaio 2013 : 01:13:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da luko


allora ci sono sostanzialmente 3 metodi
1) retro trascrizione oligo dt
2) retro trascrizione primer selettivi
3) procedura ONESTEP



Scusa luko, ma non mi sembra una suddivisione molto corretta, hai mischiato un po' le cose.

Per fare una retrotrascrizione (RT) ci sono 3 strategie che prevedono l'ultilizzo di tipi di primers diversi per retrotrascrivere l'RNA in cDNA:
1) oligodT --> retrotrascrivi tutto l'mRNA, ma non retrotrascrivi gli altri RNA (che non hanno la codina di poli-A)
2) random primers --> retrotrascrivi tutto l'RNA (sia mRNA che gli altri RNA)
3) primer specifico --> retrotrascrivi solo l'RNA relativo al tuo gene di interesse

poi dopo aver retrotrascritto puoi fare la PCR del cDNA ottenuto, quindi in sostanza partendo dall'RNA e arrivando all'amplificato della PCR fai una "RT-PCR", la RT-PCR pu essere fatta in due modi:
1) ONE-Step: metti nella stessa provetta assieme all'RNA tutti i reagenti e i due enzimi, retrotrascrittasi e DNA-polimerasi. Si ha una prima fase in cui viene retrotrascritto l'RNA e poi si ha la fase di amplificazione.
2) TWO-Step: metti in una prima provetta i reagenti per la retrotrascrizione e la retrotrascrittasi e produci il cDNA. Poi prendi il cDNA prodotto e lo metti in una seconda provetta assieme ai reageti per la PCR e alla DNA-polimerasi e lo amplifichi.

Sia nella ONE-step che nella TWO-Step puoi utilizzare uno qualsiasi dei primer detti prima. Anche se nella ONE-step molto pi comunque usare i primers specifici si possono usare benissimo anche gli altri.
Sia con la ONE-step che nella TWO-Step puoi fare la real-time.
Nella ONE-step non che fai prima la One-step e poi la real-time e quindi ti trovi una Taq in pi di mezzo, ma semplicemente metti tutti i reagenti per la real-time nella mix iniziale (assieme ai due enzimi che sono sempre retrotrascrittasi e DNA-polimerasi) e metti nello strumento per la real time, per la precisione si chiama: "One-step RT-qPCR"

Poi i motivi per cui si preferisce utilizzare una strategia piuttosto che l'altra sono veramente tanti e dipende da cosa devi fare.
La retrotrascrizione non la fai solo per farci una realtime, ma ad es. puoi farla per fare un clonaggio, in quel caso a volte pu essere vantaggioso usare un primer specifico piuttosto che un oligo dT, i random primers invece non si usano di certo.
Se invece hai bisogno di andare a vedere vari RNA, e non solo i messaggeri (sia in real-time che per altre applicazioni) allora devi utilizzare random primers.
Insomma i casi sono tanti e bisogna valutare di volta in volta in base a quello che si deve fare.
Anche sulla scelta di ONE-step piuttosto che TWO-Step i fattori sono molti e ci sono vari pro e contro.
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Vaccide
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2 Messaggi

Inserito il - 06 novembre 2018 : 17:21:38  Mostra Profilo Invia a Vaccide un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve Ragazzi, in merito alla retrotrascrizione ho un dubbio tecnico:
Quando retrotrascrivi usando primer gene specifici si deve utilizzare un solo primer che sia complementare ed antiparallelo al RNA target , corretto?
3'<------5'
5'-------------------------3'

Quindi, considerando una two-step, una volta retrotrascritto con primer specifico l'RNA in cDNA, se poi voglio fare una real time o una semplice PCR, posso utilizzare come reverse lo stesso primer utilizzato per retrotrascivere o devo utilizzare una coppia di primer pi interna a quella utilizzata per ottenere il cDNA?
Per esempio utilizzo un primer reverse1 per retrotrascivere, poi di seguito faccio una PCR con un forward e reverse1 oppure devo utilizzare un reverse2 che sia pi interno (a valle) del reverse1?

Grazie in anticipo
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Vaccide
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2 Messaggi

Inserito il - 08 novembre 2018 : 11:06:25  Mostra Profilo Invia a Vaccide un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho trovato risposta riporto il testo trovato in:
https://www.qiagen.com/it/resources/molecular-biology-methods/pcr/
Citazione:

The choice of primers for reverse transcription depends on whether one-step or two-step RT-PCR is being carried out. In one-step RT-PCR, the downstream PCR primer is also the primer for reverse transcription. Therefore, one-step RT-PCR is always performed with gene-specific primers.


In parte risponde alla mia domanda: Anche in una two-step Il primer utilizzato per retrotrascrivere pu essere utilizzato come reverse nelle amplificazioni successive
Ciao a tutti
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