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 Diluizioni seriali per efficienza Primers
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cla_mls
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4 Messaggi

Inserito il - 18 gennaio 2013 : 14:20:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cla_mls Invia a cla_mls un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao ragazzi.
Premetto: sono una super principiante per quanto riguarda la qPCR. L'ho fatta solo due volte, ma per la prima ho davanti a me i risultati.
Sto facendo un tirocinio all'estero, quindi a causa di difficolta di lingua non ho ben capito il prossimo step: é risultato che avendo una bassissima concentrazione iniziale di RNA, questa possa influenzare i miei housekeeping gene, e quindi i miei geni target. Il mio prossimo step sarį fare una diluizione seriale del campione (1:4, 1:16, 1:64....) per valutare l'efficienza dei primers.

Quello che mi chiedo é: cosa significa valutare l'efficienza dei primers? Perché questo step é necessario?

Grazie!

GFPina
Moderatore

GFPina

Cittą: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 18 gennaio 2013 : 18:57:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Premetto che se stai facendo la realtime e non sai bene come funziona dovresti leggerti un manuale, ce ne sono moltissimi in rete che spiegano bene tutto. Spiegare tutto sul forum diventa complicato, in ogni caso potrai trovare altre discussioni dove sono spiegati alcuni aspetti.

Per quanto riguarda la tua domanda specifica, l'efficienza della reazione č fondamentale se vuoi quantificare.
Ad ogni ciclo di PCR tu hai il raddoppio del tuo stampo di partenza, questo solo se l'efficienza č del 100%, se l'efficienza č inferiore avrai meno prodotto e devi tener conto di questo nei calcoli.
La classica formula 2^DeltadeltaCt tiene conto che l'efficienza sia del 100% (quindi ad ogni ciclo il prodotto di raddoppia, č quello il significato del 2), ma se l'efficienza non č 100% non č corretto usare quella formula e dovresti includere anche il dato dell'efficienza nella quantificazione.
Ovviamente ogni coppia di primers č diversa, quindi devi valutare l'efficienza per tutte le coppie di primers che utilizzi (sia per il gene di interesse che per gli housekeeping)

Poi come si faccia praticamente credo te lo faranno vedere, in due parole fai delle diluizioni seriali del tuo campione di partenza, vai a vedere i valori che ottieni, metti tutto in un grafico e dalla pendenza della retta che ottieni ti calcoli l'efficienza.
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