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 Sequenziamento shotgun e clone by clone
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Dalila909
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Inserito il - 24 gennaio 2013 : 15:14:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dalila909 Invia a Dalila909 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve, vorrei dei chiarimenti riguardo il meccanismo del sequenziamento mediante shotgun e clone by clone.

Con il metodo shotgun andiamo a sequenziare genomi abbastanza piccoli, prima di tutto frammentiamo il nostro genoma attraverso sonicazione. Amplifichiamo i frammenti tramite vettori ottenendo dei clusters di sequenze identiche per ogni nostro frammento (libreria genomica). Ogni frammento della libreria genomica può essere ora sequenziato a partire dall'una o l'altra estremità dell'inserto, quindi otteniamo le reads (forward o reverse).
Ora dobbiamo assemblare queste reads in contigs cercando delle sovrapposizioni overlap...ed ecco la prima cosa che non mi è molto chiara...se ho delle piccole sequenze di DNA sequenziate in entrambe le direzioni quando trovo le sovrapposizioni devo tenere conto in quale direzione sono le reads e in base a ciò come faccio a dire che due reads sono consecutive?.
Dopo l'assemblaggio ho la fase di finishing in cui devo manualmente rivedere i dati dell'assemblaggio e correggere eventuali errori. Invece la chiusura dei gap come si ottiene???.

Lo shotgun colone by clone si utilizza per genomi di grandi dimensioni e consiste nel creare una mappa fisica per poi applicare il metodo shotgun.
Ma la mappa la faccio dopo aver creato la libreria di cloni giusto?
e che significa quando si dice che sequenziamo le estremità dei vettori BAC per avere informazioni posizionali?

Ho le idee un pò confuse qualcuno può aiutarmi??
Anche se avete a disposizione delle dispense o dei video, sto studiando dal libro di bioinformatica Valle ma alcune precisazioni giustamente vengono omesse.

Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


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Inserito il - 24 gennaio 2013 : 19:25:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
1) Per l'assemblaggio delle reads in contig ti basi (o meglio il software si basa) sulle sovrapposizioni parziali di sequenza che ottieni al confronto di ogni read con tutte le altre. Man mano che la costruzione del contig va avanti la ricerca di sovrapposizioni parziali continua e nuove reads vengono aggiunte ad una delle estremità del contig o all'interno del contig stesso. Nota che una sovrapposizione di reads ha di per sé un suo orientamento relativo dato dalla sequenza stessa; intendo dire che (eccetto casi di sequenze ripetute e invertite) non hai dubbi su come orientare la nuova read rispetto al contig parziale in fase di assemblaggio.
Poi credo tu l'abbia già chiaro ma di ogni frammento genomico clonato riesci a sequenziare solo le estremità in questa fase.

2) I gap vengono distinti in gap di sequenza e gap fisici:
  • Gap di sequenza: questi compaiono perché by chance le reads che hai ottenuto non hanno coperto questa piccola regione dato che dei frammenti ottenuti sequenzi le sole estremità. Però tu nella libreria genomica il frammento che copre questo gap ce l'hai e non ti resta che trovarlo e completarne il sequenziamento (anche della regione interna) per colmare il gap. Questo lo identifichi andandolo a ripescare a partire dalle sequenze delle estremità che si affacciano sul gap, dalle sequenze risali al clone che le ha originate, lo prendi le lo sequenzi tutto.

  • Gap fisici: in questo caso queste sono vere e proprie lacune di DNA che non hai fisicamente in nessun clone (probabilmente per la particolare instabilità di queste sequenze nel vettore di clonaggio usato). Quindi non sono rappresentati nella genoteca. Beh qui la storia è un po' più complicata...puoi preparare una seconda genoteca utilizzando un diverso tipo di vettore (lambda ad esempio), quindi utilizzare una sonda oligonucleotidica marcata derivata dalla estremità di un contig e fare un saggio di ibridazione contro tutta la nuova genoteca, segnarti il/i clone/i che ha mostrato il segnale, e rifarti da capo con una seconda sonda marcata derivante da un'estremità di un altro contig...e così via per entrambe le estremità di ogni contig. In questo modo quando due di queste sonde ibrideranno lo stesso clone vorrà dire che quel clone contiene un frammento che copre il gap fisico. Questi vengono selezionati e sequenziati.
    Altrimenti puoi usare coppie di oligo derivanti da tutte le estremità dei contig nelle varie possibili combinazioni e usarli come primer per PCR su DNA genomico. In caso di amplificato significa che i due oligo sono abbastanza vicini nel genoma e l'amplificato quindi viene sequenziato colmando la lacuna.


3) Nello shotgun gerarchico la mappa fisica dei grandi cloni BAC te la costruisci dopo la loro creazione, certo. Questa mappa poi serve nelle fasi successive di assemblaggio e viene poi confrontata con le mappe genetiche e fisiche già collaudate per il genoma d'interesse.

4) Sequenzi le estremità dei BAC in modo da facilitare la fase iniziale di mappatura/ordinamento dei cloni BAC stessi, un po' come fai quando vuoi costruire dei contig in base alle parziali sovrapposizioni di sequenza. Una volta ordinati i vari cloni BAC si selezione il minimum tiling path e i rispettivi cloni sono usati per il vero e proprio sequenziamento.


Dimmi se ti fila il discorso!


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Dalila909
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20 Messaggi

Inserito il - 25 gennaio 2013 : 15:35:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dalila909 Invia a Dalila909 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok ho capito come si chiudono i gap, poi tra i vari passaggi effettuo anche la descrizione dei programmi che alla fine fanno tutto il lavoro (base caller e PHRED per il sequenziamento, PHRAP per l'assemblaggio)

Ricapitolando per il sequenziamento gerarchico:
Frammenti sempre il genoma. Questi frammenti vengono inseriti in BAC. Si costruisce una libreria di BAC con inserti cromosomici grandi. Ordini i BAC effettuando un mappaggio con enzimi di restrizione o un mappaggio di STS
Da questi BAC viene selezionato un sottoinsieme di cloni (il numero minimo di cloni in grado di ricoprire l intero genoma con sovrapposizione minima). Il minimal tiling path può essere costruito tramite ibridazione: identificando i cloni in cui vi sono particolari sequenze (STS....) ibridando queste sequenze con sonde radioattive o DNA fingerprinting dove i cloni sono confrontati ed allineati in base ai profili di digestione con enzimi di restrizione.
Ad ogni BAC viene effettuato il metodo classico shotgun quindi per oggni BAC:
frammentazione, subclonaggio in vettori plasmidici (quindi prendi ogni sequenza l'amplifichi tramite PCR, la inserisci nel vettore plasmidico e inserisci quest'ultimo nel batterio e fai un'altra libreria ma questa volta plasmidica contenente inserti più piccoli?)
Ora viene effettuato per ogni clone il sequenziamento bidirezionale, l'assemblaggio ecc....
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 25 gennaio 2013 : 20:46:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si tutto ok secondo quanto so.
Due cose giusto per precisare:
<<quindi prendi ogni sequenza l'amplifichi tramite PCR, la inserisci nel vettore plasmidico e inserisci quest'ultimo nel batterio e fai un'altra libreria ma questa volta plasmidica contenente inserti più piccoli?>>
Perché metti uno step di PCR? Penso tu debba solo estrarre il DNA a partire dal clone BAC, digerirlo per estrarre l'inserto e quindi prenderti questo dal gel e usarlo come materiale di partenza per la subclonazione in vettori plasmidici o fagici.

Poi nel metodo shotgun esteso a tutto il genoma le librerie che crei in realtà sono almeno due, contenenti inserti di dimensioni diverse (ad esempio 2kb e 10kb).


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Dalila909
Nuovo Arrivato



20 Messaggi

Inserito il - 25 gennaio 2013 : 21:23:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dalila909 Invia a Dalila909 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No hai ragione, non centra nulla la PCR! Si alla fine se il genoma procariotico è molto piccolo fai direttamente lo shotgun con una libreria, se è un pò più esteso serve il passaggio con gli inserti medio lunghi. Invece per il genoma umano fai direttamente due librerie (inserti lunghi, inserti piccoli) e ad ognuno degli inserti piccoli fai lo shotgun! ah quanto tempo per mettere in ordine tutti i concetti (alla fine abbastanza semplici). Grazie per il tuo tempo!
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 25 gennaio 2013 : 21:27:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Nulla! Serve anche a me per tenerli a mente..sto preparando anch'io un esame XD


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francifra
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Inserito il - 06 giugno 2014 : 20:58:47  Mostra Profilo Invia a francifra un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve,vorrei anche io dei chiarimenti sulla tecnica clone per clone e sulla tecnica shutgun. 1) se io ho un bac che contiene un pezzo di dna e lo vado a frammentare come e' possibile poi che i pezzi si sovrappongono se frammento un pezzo??? 2) non ho capito a cosa servono i pezzi piu' grandi usati nello shutgun,ossia sequenzio prima una libreria di frammenti piccoli e poi una libreria di frammenti piu' grandi solo alle estremità e una con frammenti ancora piu' grandi e poi come procedo per riallinearli? e per sequenziare le parti in mezzo ai pezzi grossi di cui ho sequenziato solo l'estremità? grazie se rispondete
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


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Inserito il - 07 giugno 2014 : 19:39:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scritto da MolecularLab Mobile

Intanto quando "frammenti un BAC" frammenti un solo clone, ma non una sola molecola di DNA. Lo stesso DNA che ottieni da un clone BAC viene frammentato per sonicazione, quindi casualmente e per forza di cose troverai frammenti diversi che si sovrappongono!
Per l'altra questione i frammenti grandi ti servono per aiutarti a ricostruire l'ordine corretto delle "reads" specialmente quando hai a che fare con sequenze ripetute che non sai dove piazzare. Bhe le loro parti centrali le sequenzierai a partire dai frammenti più piccoli!


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francifra
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Inserito il - 07 giugno 2014 : 21:06:23  Mostra Profilo Invia a francifra un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille!! Ma ancora non riesco a capire la parte dei BAC! Non capisco come avendo un bac che contiene UN SOLO frammento del mio dna io poi frammentandolo per sonicazione possa ottenere pezzi sovrapponibili? allora ho piu' BAC che contengono lo stesso frammento uguale? altrimenti come si sovrappongono scusa?
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


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Inserito il - 08 giugno 2014 : 13:10:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Forse se ti spiego operativamente come fai capisci che è possibile :)
Quando ti riferisci a "un clone BAC" praticamente intendi una colonia batterica originatasi da un singolo evento di trasformazione con un singolo vettore contenente quel dato inserto di genoma. Se vuoi recuperare quel DNA da quella colonia per poterlo frammentare e sequenziare ti basta inocularla in terreno di crescita liquido e far crescere i batteri in modo da amplificare quel singolo clone BAC. Dalla coltura così ottenuta estrai il tuo DNA plasmidico, ottenendone una buona quantità. Parliamo di miliardi e miliardi di molecole di DNA tutte teoricamente identiche tra loro. A questo punto le puoi sonicare: qui la frammentazione è casuale, quindi per ciascuna di quelle molecole di DNA otterrai frammenti diversi in sequenza e lunghezza, in molte combinazioni diverse.
Se adesso passi al loro sequenziamento, dopo averli trasferiti in vettori idonei, otterrai diverse letture a seconda del frammento sequenziato, tutte appartenenti allo stesso BAC di origine e e tra loro potenzialmente sovrapposte (ti ricordo che con la sonicazione le molecole di DNA di uno stesso clone BAC vengono frammentate casualmente, quindi ognuna in punti diversi)! Quindi le letture che ottieni sono sovrapponibili!


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francifra
Nuovo Arrivato



11 Messaggi

Inserito il - 09 giugno 2014 : 19:18:25  Mostra Profilo Invia a francifra un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille!!!!illuminante..io mi ero bloccata perché sapevo che il bac e' ad una sola copia per cellula
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francifra
Nuovo Arrivato



11 Messaggi

Inserito il - 09 giugno 2014 : 19:24:23  Mostra Profilo Invia a francifra un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non capisco come amplifico lo stesso bac..ne ho vari con la stessa molecola?
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francifra
Nuovo Arrivato



11 Messaggi

Inserito il - 09 giugno 2014 : 20:17:54  Mostra Profilo Invia a francifra un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
un ultima cosa cosi' poi ho chiaro tutto il quadro : quando mi creo all'inizio la mia libreria in bac non e' possibile che in due bac ci finisca lo stesso frammento? come scelgo i bac per fare il subclonaggio?
GRazie e scusa ma non mi e' stato spiegato bene e il materiale su cui studiare e' ben poco
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2014 : 21:09:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si è possibile che tu abbia lo stesso frammento in due cloni distinti, ma non è un problema. Intanto sapendo le dimensioni del genoma puoi ottimizzare la quantità di DNA e cellule da usare per avere un numero sufficiente di colonie da coprire anche più volte le dimensioni del genoma (per essere sicura di non perdere pezzi) ma al contempo non averne un numero ingestibile dal punto di vista pratico. Se hai lo stesso frammento in più cloni meglio, ci sarà più lavoro ma anche dei replicati sempre utili nel confermare la bontà di un risultato.
Per la scelta dei BAC come abbiamo scritto prima nella discussione si sono basati sulla costruzione delle loro mappe fisiche per poter poi riordinare ciascun BAC lungo il cromosoma di origine e costruire un "minimal tiling path", ovvero la minimo numero di BAC necessari a coprire l'intero cromosoma. Quindi passerai al subclonaggio dei BAC scelti in questa fase.


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francifra
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Inserito il - 12 giugno 2014 : 10:11:44  Mostra Profilo Invia a francifra un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille!
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