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Mary.grace
Nuovo Arrivato
Prov.: Pistoia
Città: Pieve a Nievole
8 Messaggi |
 Inserito il - 07 febbraio 2007 : 11:53:59
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AIUTOOOO....SONO ALLA RICERCA DI QUALCUNO CHE MI SAPPIA INDIRIZZARE E DARE SUGGERIMENTI SU COME DISEGNARE PRIMERS...E' LA PRIMA VOLTA CHE MI TROVO A DOVER FARE QUESTO LAVORO E NON SO PROPRIO DA CHE PARTE COMINCIARE....HO DELLE POSSIBILITA'??CI SONO DEI SITI DI FACILE CONSULTAZIONE?
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mary.grace |
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chiarwen
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
28 Messaggi |
Inserito il - 07 febbraio 2007 : 12:13:34
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allora, da un punto di vista teorico i criteri di scelta dei primers sono:
-non devono presentare appaiamenti spuri, cioè con altre regioni del genoma che non siano le estremità dell'amplicone
-devono contenere percentuali non troppo diverse di AT e GC
-non devono appaiarsi tra loro
-non devono contenere palindromi che potrebbero causare appaiamenti interni
-non devono presentare GC o AT terminali che potrebbero ripiegarsi
-non devono avere alle 2 estremità nucleotidi che si appaiano perché altrimenti c'è il rischio che si chiudono ad anello (per es G al 3' e C al 5')
-la regione al 3' dev'essere quella che si appaia più saldamente perché la polimerasi la usa come innesco, qndi è bene che sia la regione più specifica e che termini con una G o con una C (che fanno 3 legami H anziché 2)
- devono avere una lunghezza compresa tra 15 e 25 nucleotidi, perché più lunghi aumenta la probabilità di strutture secondarie, e più corti aumenta la probabilità di trovare appaiamenti spuri in giro per il genoma
-devono avere una Tmelting paragonabile (tolleranza max 2°C di differenza; empiricamente, calcola 4°C per ogni C o G e 2°C per ogni A o T)
inoltre, tutto questo lo puoi evitare perché esistono banche dati di primers che questi calcoli te li svolgono loro. io però non le ho mai usate perché non ci ho ancora mai lavorato... spero che qualcuno te le indichi al più presto, nel frattempo spero che le mie nozioni teoriche ti abbiano dato un'idea... |
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atreliu
Amministratore
Prov.: Milano
Città: Milano
2484 Messaggi |
Inserito il - 07 febbraio 2007 : 17:28:41
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Mary.grace
Nuovo Arrivato
Prov.: Pistoia
Città: Pieve a Nievole
8 Messaggi |
Inserito il - 07 febbraio 2007 : 21:53:04
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| grazie per l'aiuto....ancora una domanda per chiarwen:ma quindi te li disegni da solo senza un programma?e come fai ad essere sicuro che non si attacchino anche da un'altra parte? Ah, i primers mi servono per un mRNA...comunque la teoria alla base è la stessa vero? grazie ancora |
mary.grace |
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chiarwen
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
28 Messaggi |
 Inserito il - 07 febbraio 2007 : 23:54:26
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beh, come ho detto, il mio è stato uno studio mooolto solo teorico  quindi non ho mai effettivamente usato i primers che disegnavo... tuttavia li posso considerare una buona approssimazione perché innanzitutto li prendevo con una composizione in nucleotidi molto varia, perché evitando ripetizioni diminuisci molto le probabilità di trovare sequenze simili; poi sequenze così miste lunghe circa 20 nt è difficile e raro ritrovarle... quindi diciamo che non controllavo , lo facevo al max in quelle due-tre pag di sequenza genomica che avevo davanti... tanto si vede abbastanza ad occhio se si ripetono.
Per l'mRNA è assolutamente uguale, solo ci sono alcuni accorgimenti che dipendono da se conosci o meno la sequnza che devi amplificare... Se la conosci prima retrotrascrivi con un primer di oligodT che funzioni a circa 42°C (temperatura bassa perché la trascrittasi inversa non è molto termoresistente), poi dopo hai DNA quindi ti scegli due primers sulla seq nota con i criteri di prima per il protocollo della PCR normale... Se non conosci la sequenza devi fare una RACE, che ha bisogno di qualche accortezza in più... è un pò lunga, credo che la trovi sicuramente in giro però! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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ebola
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: roma
6 Messaggi |
Inserito il - 08 febbraio 2007 : 18:40:42
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allora,io li disegno a mano e verifico tramite programmi disponibili su internet...cominciamo:
xil fw:l'idale sarebbe un primer di 24basi circa,ma se piu lungo o piu corto pazienza,vanno bene lo stesso.Sarebbe meglio che iniziassaro e finissero con g o c in quanto formano legami piu forti e stabili...poi devi vedere se vuoi mettere un sito di restrizione,e allora ti conviene spostarti sulla sequenza xvedere se c'è una sequenza simile,e quindi nel disegno cambi i nucleotidi che ti consentono di formare il sito,meno ne cambi meglio è..il sito di restr.cmq nn deve essere all'interno della sequenza che verra trascritta,falla un po prima...all'inizio del primer conviene mettere una codina di qualche nucleotide,tanto poi verra eliminata con la restrizione....stai attenta a mantenere il frame.
xil rev:come sopra solo che lo devi scrivere al contrario,es.
5'-agagagagagagagagag-3'
3'-gagaggagagagaggagg-5'-questo è il tuo rev,lo devi leggere cosi
ggaggagagagaggect ect,....
poi vai su un data base e fai un blasta che ti controlla la sequenza e ti viene allineata,se è sbagliato lo vedi..
dimenticavo,la tm nn piu di 65 gradi.........ciao |
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