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 Ceppo di E.coli migliore per l'espressione proteica?
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edoardodp
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Inserito il - 08 febbraio 2013 : 10:45:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di edoardodp Invia a edoardodp un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti!sto tentando di fare un'espressione proteica in E.coli dopo aver trasformato con il mio plasmide.Ho indotto l'espressione con 1mM di IPTG e fatto lisati dopo diversi tempi di induzione per vedere(in elettroforesi)i diversi gradi di espressione della mia proteina. Il problema Ŕ che,nonostante si noti una buona dipendenza dall'induzione con IPTG (al tempo 0 prima della somministrazione di IPTG infatti non vedo espressione proteica), il livello di espressione della proteina rimane comunque basso anche dopo molte ore di induzione.
Ho pensato quindi di aver scelto male il ceppo di E.coli usato per l'espressione: io sto usando le XL-1 BLUE ma ho sentito che forse sarebbe meglio usare le BL21-DE3. cosa ne pensate?secondo voi qual'Ŕ il ceppo migliore?

grazie a tutti per l'aiuto


Utente Junior



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Inserito il - 08 febbraio 2013 : 11:07:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lÓ Invia a lÓ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io uso le BL21 DE3 e mi trovo molto bene.
per˛ secondo me non dovresti limitarti ai tempi di induzione nelle tue prove, ma dovresti provare anche OD diverse, diverse concentrazioni di IPTG e anche temperature diverse di induzione nel caso. io nelle mie prove di induzione provo tutte queste variabili.
per l'OD faccio: 0.2 0.4 0.6 e anche 1.
per l'IPTG: 0.1mM 0.25mM 0.5mM 1mM
per le temperature (e di solito Ŕ proprio l'ultima cosa che testo), di solito provo a 37 30 25 e 15 (in questo caso pi¨ bassa Ŕ la temperatura e pi¨ lungo Ŕ il tempo di induzione).

Ciao ciao!
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edoardodp
Nuovo Arrivato




11 Messaggi

Inserito il - 08 febbraio 2013 : 11:32:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di edoardodp Invia a edoardodp un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie mille! :) comunque,anche se non l'ho scritto,anch'io ho provato a diverse concentrazioni di IPTG (0,2 mM e 1mM) e diverse temperature (37░ e 25░).
per quanto riguarda l'OD invece ho sempre fatto l'induzione con l'OD tra 0,5 e 0,6 (ma solo perche nella maggior parte degli articoli ho sempre trovato questo parametro).Ovviamente un OD maggiore significa pi¨ cellule e pi¨ proteine ma a quel punto il risultato non Ŕ paragonabile con gli altri lavori in rete.
GiÓ che ci sei ti chiedo anche un'altra cosa : te il dosaggio dei lisati come lo fai?(per caricare lo stesso quantitativo di proteine nei pozzetti del gel) io ho provato a fare un BCA ma mi viene una concentrazione troppo alta e lo spettrofotometro non me la legge..ero abituato a fare il BCA con cellule di linea eritrocitaria ma per i batteri non funziona(non sono ancora tanto esperto di e.coli)
grazie ancora!! (sono nuovo del sito ed Ŕ fantastico trovare tanta gente che condivide passione,lavoro e ahimŔ anche qualche piccolo problema xD)
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Utente Junior



565 Messaggi

Inserito il - 08 febbraio 2013 : 14:43:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lÓ Invia a lÓ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io di solito raccolgo l'estratto dopo la lisi e lo quantifico allo spettrofotometro, dopo aver fatto una curva di BSA.
per˛ tratto anche il pellet che mi resta dopo la lisi con un tampone contenente urea, questo perchŔ la proteina, se non la vedo nella parte solubile, potrebbe essere nella parte insolubile.
Dopo aver quantificato allo spettrofotometro diluisco gli estratti 1:5 in acqua e poi carico su un SDS gel (perchŔ, ti sarai accorto, gli estratti sono un pochino difficili da caricare, inoltre cosý sul gel hai una risoluzione migliore).
Ora ti ho detto tutto in generale, ma se ti servono i dettagli, tipo i tamponi o anche altro fammi sapere.
Non mi Ŕ mai successo che lo spettrofotometro non mi leggesse la concentrazione perchŔ troppo alta, a meno che tu non usi un nanodrop, in questo caso Ŕ diverso perchŔ usi dei "tappini" nella lettura che sono tarati per leggere entro un determinato range di concentrazione: se non hai il tappo giusto lo strumento ti dice che la concentrazione Ŕ troppo alta (o,viveversa, troppo bassa).
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edoardodp
Nuovo Arrivato




11 Messaggi

Inserito il - 08 febbraio 2013 : 17:47:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di edoardodp Invia a edoardodp un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si,penso che il mio probloema nel dosaggio derivasse da una curva di taratura non adatta...prover˛ a fare la curva di BSA e la lettura dei campioni; ma tu dosi sempre con il BCA? se no posso sapere il protocollo che utilizzi?
Per quanto riguarda il frazionamento solubile-insolubile io utilizzo il lisozima..penso che il concetto sia lo stesso,l'unico problema Ŕ che ,quando vado a colorare il gel(di solito li faccio al 18%), il lisozima (MW molto basso) mi oscura il segnale della mia proteina (12-15 kDa).
di quali tamponi parli? io invece diluisco i pellet batterici in sds 1% e lisi in sample buffer 1x.
grazie ancora per tutte le informazioni utili che mi stai dando!!
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GFPina
Moderatore

GFPina

CittÓ: Milano


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Inserito il - 08 febbraio 2013 : 18:58:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma perchÚ stai utilizzando le XL-1 BLUE per l'espressione?
Scusa la domanda, ma lo sai come funziona l'espressione delle proteine ricombinanti in E. coli?
Non Ŕ una domanda per cattiveria eh, sia ben chiaro, ma credo sia fondamentale "prima" di iniziare a fare gli esperimenti aver ben chiaro cosa si sta facendo per evitare di perdere tempo facendo cose inutili.

Comunque detto in due parole (poi magari va a studiarti qualcosa):

Il sistema di espressione batterico pi¨ utilizzato (poi in realtÓ ce ne sono altri) Ŕ il sistema T7 che prevede l'utilizzo di:
- un vettore nel quale sia inserito il tuo gene di interesse a valle del promotore T7
- un ceppo di E. coli che esprima la T7 RNA polimerasi
(N.B. la T7 RNA polimerasi Ŕ una proteina virale e non Ŕ normalmente presente nei batteri, per questo motivo esistono batteri "modificati" che la producono)

Il sistema Ŕ semplice (vedi figura)
la T7 polimerasi prodotta dal batterio si lega al suo promotore sul vettore e inizia la trascrizione del gene.
Per rendere il sistema indicibile e quindi esprimere la proteina solo quando lo decidi tu si utilizza l'operatore Lac al quale va a legarsi il repressore bloccando la trascrizione, quando aggiungi l'induttore (IPTG) il repressore si stacca e viene consentita la trascrizione.
La regolazione pu˛ avvenire a due livelli, LacO sul promotore T7 del vettore e/o LacO sul promotore Lac del batterio.



Detto questo, le tue cellule XL1-Blue NON esprimono la T7 polimerasi, sono infatti cellule per il "clonaggio" non per l'espressione e il sistema NON FUNZIONA!

Quindi innanzitutto procurati delle cellule giuste per l'espressione, poi procedi seguendo i consigli di lÓ.

Per quanto riguarda le altre domande, per la quantificazione DEVI fare una curva standard, usare solo l'assorbanza non Ŕ sufficiente per quantificare.
Il lisato batterico Ŕ in genere molto concentrato, devi leggerlo diluito.
Tra l'altro il modo corretto di procedere per le quantificazioni (sempre non solo per i batteri) sarebbe quello di fare varie diluizioni seriali dello stesso campione e leggerle tutte ed estrapolare la concentrazione solo quando sei in una zona di linearitÓ. (il 90% delle persone comunque lo ignora o se ne frega!)

Per quanto riguarda i "corpi insolubili" sono i corpi di inclusione (magari va a cercarti cosa sono) e non c'entra niente il lisozima, il lisozima lisa la parete batterica.
I corpi di inclusione vengono solubilizzati con UREA o con Guanidinio.
Infine, se la tua proteina ha un PM vicino a quello del lisozima DEVI fare una lisi senza utilizzarlo, altrimenti ti copre il segnale sul gel.
La lisi Ŕ un po' pi¨ difficoltosa, ma si pu˛ benissimo fare, ci sono tantissimi protocolli.

Spero di averti chiarito un po' le idee, per˛ ti invito vivamente ad andare a leggerti un po' di teoria.

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edoardodp
Nuovo Arrivato




11 Messaggi

Inserito il - 08 febbraio 2013 : 21:37:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di edoardodp Invia a edoardodp un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao GFpina! grazie per i consigli e scusa perche probabilmente avrei dovuto scrivere maggiori dati prima di fare domande specifiche. comunque il problema del sistema di induzione non c'Ŕ perche il mio plasmide ha al suo interno il gene per la t7 polimerasi.Inoltre sul gel vedo una sostanziale differenza tra la banda relativa al tempo 0(prima dell'induzione con IPTG) e quelle relative a vari tempi di induzione. il mio problema Ŕ solo relativo alla quantitÓ visto che successivamente dovr˛ procedere ad una purificazione. per quanto riguarda il lisozima, lo usiamo proprio per vedere se la proteina precipita oppure no. con l'urea denaturo la proteina e visto che dopo devo purificarla non mi sembra il giusto approccio(Ŕ anche vero che proteine piccole come la mia dovrebbero rinaturarsi spontaneamente una volta tolta l'urea...su questo fatto mi informer˛).
Per il dosaggio prover˛ come mi hai consigliato.
grazie ancora per i consigli!
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GFPina
Moderatore

GFPina

CittÓ: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 09 febbraio 2013 : 01:59:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ah ok se usi un plasmide che contiene la T7 polimerasi allora non c'e problema, ma dato che la tua prima domanda era sulle celluel da usare ho dato per scontato che non sapessi la differenza!

Per quanto riguarda il lisozima, come ti dicevo serve per rompere la parete batterica, non fa altro che idrolizzare i legami glicosidici dei peptidoglicani nella parete. Ma non solubilizza i corpi di inclusione! Per quelli ci vuole Urea o guanidinio! Se la tua proteina va a finire nei corpi di inclusione non la recuperi certo cosý.
Nel caso la proteina sia nei corpi di inclusione, il lisozima ti aiuta semplicemente perchŔ rompendo la parete la lisi Ŕ pi¨ efficente e "togli di mezzo" pi¨ facilemnte tutto il contorno (parete e lisato batterico) ottenedo dei corpi di inclusione abbastanza puri. Per˛ dopo aver ottenuto dei corpi di inclusione puri (e ben lavati) devi usare un agente denaturante per solubilizzarli.
Non so per quale motivo tu non voglia denaturare la proteina, il fatto che la devi purificare non Ŕ un problema in sÚ, dipende per˛ dal metodo di purificazione che usi. In ogni caso una prova per vedere se si trova nei corpi di inclusione potresti farla, poi puoi pensare di modificare le condizioni in modo da averne il pi¨ possibile solubile e infine (se proprio non vuoi usare denaturanti) usare tanto volume di coltura batterica in modo da avere una buona quantitÓ di proteina.
Il lisozima comunque non Ŕ l'ideale se hai una proteina attorno a 14KDa e, ti ripeto, se ne pu˛ benissimo fare a meno!
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edoardodp
Nuovo Arrivato




11 Messaggi

Inserito il - 09 febbraio 2013 : 12:38:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di edoardodp Invia a edoardodp un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scritto da MolecularLab Mobile

Quindi secondo te cosa potrei usare per fare la lisi della parete senza usare il lisozima?(per vedere appunto se la mia prot Ŕ nella frazione solubile o nei corpi di inclusione).la purificazione avverrÓ su colonna im
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edoardodp
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Inserito il - 09 febbraio 2013 : 12:42:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di edoardodp Invia a edoardodp un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scritto da MolecularLab Mobile

Quindi secondo te cosa potrei usare per fare la lisi della parete senza usare il lisozima?(per vedere appunto se la mia prot Ŕ nella frazione solubile o nei corpi di inclusione).la purificazione avverrÓ su colonna di sefarosio accoppiato alla poli-l-proline(alla quale si lega la mia proteina)
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Utente Junior



565 Messaggi

Inserito il - 11 febbraio 2013 : 11:53:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lÓ Invia a lÓ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
per i corpi inclusi:

-pesi il pellet che hai alla fine, dopo la lisi (cioŔ quello che ti resta dopo che hai prelevato il surnatante, ossia la parte solubile)

-aggiungi 3 volumi di questo tampone : trisHcl ph8 0.01 M, NaPO4 ph8 0.1 M, NP40 0.01%, Urea 6M. Poi aggiungi il lisozima.

-20 min in ghiaccio
- Sonichi
- centrifugni a 13000 rpm per 20 min a 4░C, e recuperi i surnatanti (la tua parte insolubile).

Quantifichi e carichi sul gel SDS-PAGE alla percentuale che pi¨ di aggrada.
Questo Ŕ il protocollo che uso io, poi probabilmente ce ne saranno altri.
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