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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
 Inserito il - 11 febbraio 2013 : 01:26:30
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Ciao ragazzi, :)
avrei bisogno di un aiuto: non dispongo di un testo (non avendocelo il docente consigliato!) che tratti questo argomento in maniera chiara.
Si tratta della diagnosi prenatale dell'anemia falciforme. Vi riporto in violetto i miei dubbi, spero che possiate darmi una mano - si tratta di un argomento "classico" del RFPL e spero che qualcuno di voi ricordi qualcosa/conosca un articolo ben fatto al riguardo.
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In pratica, da quel che ho capito, si possono prelevare campioni di cellule del nascituro per analizzarne il contenuto. In particolare, ci si concentra sul gene per le catene beta delle globine.. E se ne studia la sequenza.
In particolare, ci si sofferma su un frammento di DNA (presumo, del cromosoma 11, che č quello con i geni specifici per le catene "beta-like") in cui č contenuto il sesto codone, che dovrebbe essere GAG ma che nell'anemia falciforme č GTG (tant'č vero che il sesto amminoacido della catena beta č una valina al posto dell'acido glutammico, nell'HbS).
La tecnica RFLP si basa sull'utilizzo di enzimi di restrizione che, riconoscendo apposite sequenze sul DNA bersaglio, effettuano dei tagli nucleasici e quindi rompono la sequenza di base in piů frammenti.
La modifica del codone GAG->GTG rimuove uno dei siti di riconoscimento per l'enzima di restrizione, cosicché:
a) nel caso di un frammento prelevato da una persona sana ( con sesto codone GAG), si verificheranno tot (non so quanti) tagli, e quindi un tot. (non so quanti!) numero di frammenti;
b) nel caso di un frammento prelevato da una persona malata di HbS (sesto codone GTG), verrŕ "saltato" un taglio di restrizione, perché manca uno dei siti di riconoscimento. Quindi un frammento in meno rispetto al caso precedente.
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Chiaro fin qui?
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Ora, la prassi di laboratorio prevederebbe (e questo lo deduco io perché non c'č scritto):
1) estrazione delle cellule;
2) relativa purificazione del DNA;
3) isolamento della regione di DNA desiderata (come si fa? Combino l'attivitŕ di endo/esonucleasi, magari dopo una FISH?)[/[purple]];
4) AMPLIFICAZIONE della regione desiderata mediante tecnica PCR.
Il problema č che non avendo un protocollo preciso non so QUANTO sia lungo questo frammento di partenza!
Sul materiale del mio docente č segnato 725 bp. Alché, ho cercato su internet e ho trovato questo:
http://www.glowm.com/resources/glowm/cd/pages/v5/v5c076.html?SESSID=1uouj9752v8tev2t39f11i6um5
Se scorrete un po' in basso, nel paragrafo EXAMPLES OF DNA-BASED DIAGNOSIS, troverete:
Citazione:
Recently, more rapid diagnosis of sickle cell has been possible using PCR. With this method, a 725 bp region that includes the sickle cell mutation is amplified. The amplified DNA is digested with Bsu II, and then the digested product is separated by electrophoresis. The gel is stained with ethidium bromide, and the banding patterns can be directly visualized under ultraviolet light
E fin qui tutto ok. Solo che, guardate nella didascalia della figura immediatamente sottostante cosa dice:
Citazione:
After digestion with Cvn I and hybridization to a #946;-globin probe, DNA from individuals with sickle-cell anemia yields a 1.3 kb fragment, DNA from individuals with two normal #946;-globin genes yields a 1.1 kb fragment, and carriers have 1.1- and 1.3-kb fragments.
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[purple]..Cioč, scusate, ma se il frammento di partenza (PRIMA della digestione con enz. di restrizione) era di 725 bp, da dove escono i frammenti di 1.1kb e di 1.3 kb?
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Tra l'altro, il mio docente fa riferimento alla nucleasi Mst II, e non a quella Bsu II. Perň comunque non mi trovo!
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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2013 : 10:03:24
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Mi permetto di fare un piccolo UP. :) So bene che avete i vostri impegni e non voglio metter pressione a nessuno, perň avrei davvero bisogno di un riscontro.
Un saluto |
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Geeko
Utente
Cittŕ: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2013 : 10:51:08
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Ho trovato una presentazione con la risposta che cercavi
http://www.medicina.unifg.it/Fiocco/Fiocco_Odonto/tecniche%20biologia.pdf
Cerca "anemia" con la funzione trova, cosě vai alle slide che ti interessano.
L'incongruenza nasceva dal fatto che quelli citati sono due approcci simili, ma non identici.
Solitamente veniva usato il metodo Southern con sonda marcata: qui non c'č lo step di PCC; estrai il DNA genomico dal sangue del paziente, lo tratti con MstII, lo corri su gel e lo trasferisci sulla membrana dove lo ibridi con una sonda che riconosce la regione a destra della mutazione puntiforme. In questo caso vedi una banda di 1.1kb nel wt omozigote, una banda di 1.3kb nel malato ed entrambe le bande nella condizione eterozigote.
Invece se utilizzi lo step di PCR non hai bisogno della sonda perché vedi direttamente su gel le bande della regione amplificata e trattata con l'enzima di restrizione dopo colorazione con bromuro di etidio.
In questo caso amplifichi la regione (di 725bp) e la tratti con MstII, corri su gel e fai lo staining. Ora ottieni profili diversi a seconda del genotipo dell'individuo:
s/s : una banda
A/s : tre bande
A/A : due bande
ps. lo step di di "isolamento della regione desiderata" indicato da te come (4) non č necessario, o meglio, lo fai direttamente per PCR nel secondo caso : ) |
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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2013 : 14:02:11
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Oh! :) Adesso mi sento molto piů sicuro - si trattava di metodiche differenti.
Grazie mille della dritta, Geeko! |
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Geeko
Utente
Cittŕ: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 12 febbraio 2013 : 14:10:18
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| Niente! Students solidarity XD |
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Diagnosi dell'anemia falciforme con tecnica RFLP
