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Tag   PCR    primer    Taq polimerasi  Aggiungi Tag

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Autore Discussione  

Geeko
Utente

Ctenophor1.0
Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 14 febbraio 2013 : 14:47:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Parliamo della semplice PCR.
Ora mi è venuto un dubbio che non ho risolto al 100%.

Abbiamo i soliti 3 step:
  • Denaturazione (94°C)
  • Annealing (50-65°C)
  • Elongazione (72°C)

Ora la domanda è: se i primer hanno una temperatura di annealing di 60°C, come fanno a rimanere ibridati al template per la fase di elongazione se questa avviene a 72°C?

Mi sono dato due spiegazioni, se volete le metto, altrimenti preferisco non influenzare le risposte XD


GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 15 febbraio 2013 : 19:03:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Va beh però con questa affermazione ti sei fregato:
Citazione:
Messaggio inserito da Geeko
Mi sono dato due spiegazioni, se volete le metto, altrimenti preferisco non influenzare le risposte XD


ora voglio sapere le tue spiegazioni prima di rispondere, se hai voglia di scriverle, altrimenti non ti preoccupare, ti risponderò comunque.

Tranquillo, so la risposta non verrò influenzata!
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 15 febbraio 2013 : 19:53:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
XD Ok, ammetto non aver cercato da nessuna parte e mi sono buttato subito a scrivere qui..

Allora come prima spiegazione o pensato che 72°C è la temperatura alla quale la Taq polimerasi ha il suo optimum di attività catalitica, ma questo non significa che non possa legare il DNA anche a temperature più basse e così facendo "bloccare" i primer sul template impedendone la denaturazione fino all'elongazione.
Ok qui però il problema era che non so se la quantità di polimerasi sia sufficiente a bloccare in loco tutti i primer!

Come seconda spiegazione ho pensato che la T di annealing corrisponde a quella temperatura alla quale il 50% dei primer è ibridato allo stampo e che anche quei pochi primer rimasti (se ne rimangono) ibridati a 72°C possono funzionare da inneschi, dopotutto sappiamo che l'efficienza di amplificazione di una PCR non è mai del 100%.

(di sicuro la spiegazione è la terza, quella a cui non ho pensato )


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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2013 : 00:37:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
È giusta la prima! Bisogna solo aggiungere qualche considerazione.
Come dici giustamente tu 72ºC è la temperatura alla quale la Taq ha il suo optimum, ma a temperature più basse non solo è in grado di legarsi ai primers ma anche di iniziare la sintesi, anche se l'efficienza è bassa e la reazione è lenta. Questo però fa sì che vengano aggiunti alcuni nucleotidi e il primer "si allunga" di conseguenza aumenta la sua Tm e all'aumentare della temperatura non si staccherà dallo stampo consentendo alla polimerasi di continuare la sua azione, questa volta con maggiore efficienza.
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Grön
Utente Junior



220 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2013 : 00:40:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Grön Invia a Grön un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hmm, bella domanda! Anche io me lo chiesi qualche tempo fa, feci qualche ricerca ma ancora non ne son venuto del tutto a capo..

C'è anche da dire che probabilmente la Taq polimerasi non si attiva ESATTAMENTE a 72°C, come se la temperatura fosse un interruttore, ma dovrebbe avere una blanda attività già verso i 60°-65°C (un po' come tutti gli enzimi, con le loro curve di optimum di pH e temperatura).

Quindi è probabile che il filamento già cominci ad allungarsi man mano che la temperatura sia portata da 60 a 72°C (optimum della TaqPolimerasi).

In questo modo la T-melting dell'ibrido "primer+ ssDNA" dovrebbe salire un po'.

E poi penso proprio che la tua osservazione sul 50% della Tm sia corretta!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2013 : 00:48:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grön mi sa che abbiamo scritto nello stesso momento, comunque direi che le tue considerazioni sulla prima spiegazione sono corrette.

Sul fatto invece della Tm e del 50% dei primers legati non sono molto d'accordo, alzando la temperatura non è che ti troveresti con metà dei primers appaiati perfettamente e metà staccati, ma i primers sarebbero attaccati in maniera non molto stabile e questo creerebbe dei problemi per la polimerezzazione, soprattutto se il primer non è appaiato bene al 3'.
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Grön
Utente Junior



220 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2013 : 01:08:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Grön Invia a Grön un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si, mi sa che abbiam scritto a distanza di pochissimo tempo.

Nel frattempo stavo cercando nella cartella dei lucidi (che salvo sul pc man mano che studio) qualcosa che confermasse quel che Geeko aveva già intuito - ma non ho trovato le slide dove avevo letto questo dettaglio dell'attività della Taq a temperature leggermente inferiori ( o superiori) ai 72°C.

Però, a quanto, vedo non ce n'è bisogno - con il tuo parere siamo più sicuri.

_

Un po' devo ammettere che la questione della T-melting intesa come "temperatura a cui il 50% dei filamenti è denaturato" mi tentava come ulteriore possibile spiegazione, però in effetti è un po' un controsenso fare affidamento su questo parametro.
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2013 : 08:50:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Uno dei migliori titoli di topic visti di recente! :)

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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2013 : 09:36:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beeene, grazie dei pareri e delle considerazioni!
Mi fa piacere averci inzeccato XD

Infatti la seconda spiegazione la vedevo un po' controversa; alla temperatura di melting (che non per forza coincide con quella usata per l'annealing) il DNA non si trova già più perfettamente appaiato al template e presenta dei bulge o delle estremità spaiate (alla fine alla Tm troviamo una situazione di instabilità dinamica della doppia elica). Se saliamo ancora con la temperatura è praticamente impossibile che la polimerasi possa trovare un innesco ben posizionato con l'estremità 3'-OH pronta per avviare la reazione.



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