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 esercizio su clonaggio in plasmidi
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STEFANIApcr
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lampo rosso
Prov.: Brescia
Città: Brescia


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Inserito il - 20 febbraio 2013 : 16:31:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di STEFANIApcr Invia a STEFANIApcr un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ragazzi, mi servirebbe un vostro aiuto per questo esercizio di clonaggio in vettori plasmidici. il testo è il seguente:

Si vuole eseguire il subclonaggio di entrambi i frammenti di DNA (A e B), precedentemente clonati in due differenti plasmidi, nel sito di policlonaggio di un vettore plasmidico (C) utilizzando solamente enzimi di restrizione, DNA ligasi e DNA polimerasi Klenow.
Proporre uno schema di clonaggio.

Vi ringrazio anticipatamente!!!!

Immagine:

20,37 KB

Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 20 febbraio 2013 : 17:01:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh proponici tu una strategia di clonaggio!
Almeno i passaggi teorici di come si subclona un frammento di DNA


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STEFANIApcr
Nuovo Arrivato

lampo rosso

Prov.: Brescia
Città: Brescia


26 Messaggi

Inserito il - 20 febbraio 2013 : 17:24:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di STEFANIApcr Invia a STEFANIApcr un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho provato a risolvere l'esercizio in questo modo:

Ho utilizzato gli enzimi di restrizione HindIII e SmaI per tagliare plasmide ricombinante A, generando quindi un frammento di DNa esogeno con un estremità 5' protruding a sinistra e un'estremità piatta a destra.

Ho utilizzato gli enzimi EcoRI e BamHI per tagliare il plamide ricombinante B, generando perciò un frammento di Dna la cui estremità sinistra è un estremità 5' protrudente e l'estremità destra pure. avendo a disposizione una Klenow, posso riempire l'estremità protrudente EcoRI e anche se con minor efficienza effettuare una ligazione tra le estremità piatte SmaI del frammento generato da A e l'estremità piatta appena riempita del frammento generato da B.

A questo punto mi ritrovo con una molecola in cui l'estremità sinistra è compatibile con il sito di restrizione del plasmide C (HihIII) ma l'estremità destra non è compatibile con PstI perchè ho un BamHI! Come posso fare se non è consentito usare linker o adaptor?

probabilmente bisogna usare un provedimento diverso da quello usato da me! non avendo nessun supporto, chiedo aiuto!!
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 20 febbraio 2013 : 17:33:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Pensa che io non lo avevo interpretato così, credevo che dovessi inserire i due inserti nel plasmide C uno alla volta e ottenere due diversi plasmidi C.


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STEFANIApcr
Nuovo Arrivato

lampo rosso

Prov.: Brescia
Città: Brescia


26 Messaggi

Inserito il - 20 febbraio 2013 : 17:40:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di STEFANIApcr Invia a STEFANIApcr un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
umh...ora mi fai venire il dubbio...però leggendo il testo sembra che la voce "entrambi i frammenti di DNA (A e B), precedentemente clonati IN DUE DIFFERENTI plasmidi, nel sito di policlonaggio DI UN VETTORE plasmidico (C)"si riferisca a un unico plasmide C.. Non è che la Kenow si può usare per appiattire anche le estremità BamHI e PstI? si può fare? sempre nel caso che entrambi i frammenti vengano subclonati nello stesso vettore..
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 20 febbraio 2013 : 17:45:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La Klenow la usi per fare il filling a quanto ne so. Quindi ok per BamHI, ma non per PstI. Qualcun'altro può confermare magari.


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STEFANIApcr
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lampo rosso

Prov.: Brescia
Città: Brescia


26 Messaggi

Inserito il - 20 febbraio 2013 : 17:49:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di STEFANIApcr Invia a STEFANIApcr un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ah, giusto! PstI genera estremità 3'protruding..
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 20 febbraio 2013 : 18:00:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma puoi benissimo ottenere tutte estremità blunt, sia per l'inserto che per il plasmide C tagliato solo con HindIII.
Comunque sul passaggio
Citazione:
avendo a disposizione una Klenow, posso riempire l'estremità protrudente EcoRI e anche se con minor efficienza effettuare una ligazione tra le estremità piatte SmaI del frammento generato da A e l'estremità piatta appena riempita del frammento generato da B.

Ricorda che qui se fai il filling non puoi discriminare un'estremità dall'altra, ottieni entrambe le estremità blunt!


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STEFANIApcr
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lampo rosso

Prov.: Brescia
Città: Brescia


26 Messaggi

Inserito il - 20 febbraio 2013 : 18:36:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di STEFANIApcr Invia a STEFANIApcr un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
E' un bel rompicapo! Comunque grazie per il sostegno! A presto!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 20 febbraio 2013 : 20:57:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Suggerimento: prova ad inserire nel vettore C prima un frammento e poi l'altro!
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 21 febbraio 2013 : 13:50:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sinceramente trovo il testo dell'esercizio scritto davvero in modo superficiale e vago, non vale neppure la pena perderci tempo.

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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STEFANIApcr
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lampo rosso

Prov.: Brescia
Città: Brescia


26 Messaggi

Inserito il - 21 febbraio 2013 : 19:54:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di STEFANIApcr Invia a STEFANIApcr un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
GFPina! forse mi hai illuminato! allora, ho seguito il tuo consiglio inserendo prima un frammento in C e poi l'altro:

Ho tagliato il plasmide ricombinante A con gli enzimi HindIII e PstI.

successivamente linearizzo il plasmide C utilizzando gli stessi enzimi. siccome le estremità del frammento A sono compatibili con quelle generate dalla digestione di C posso fare ligazione. mi si forma quindi il ricombinante C avente i siti HindIII, SmaI e PstI.

Ora, ho pensato di utilizzare l'enzima SmaI per riaprire C, generando un vettore (ricombinante) con estremità piatte.

Il vettore B ricombinante lo faccio reagire con gli enzimi EcoRI e BamHI, generando un frammento con due estremità 5' protrudenti, che possono essere substrati della Klenow che dispongo. la Klenow può appiattire le estremità adesive EcoRI e BamHI ottenendo quindi un inserto B con estremità piatte. tale inserto lo uso per fare una reazione tra estremità blunt con il vettore avente le estremità SmaI.

Aspetto una tua conferma/correzione Grazie per la pazienza!!!
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 21 febbraio 2013 : 21:38:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Teoricamente ci siamo.
Come già riportato, la ligazione avrà un'efficienza minore dovuta all'estremità blunt.
Inoltre nella seconda reazione (AC + B) il 50*% dei frammenti si inserirà nella direzione opposta a quella desiderata.

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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STEFANIApcr
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lampo rosso

Prov.: Brescia
Città: Brescia


26 Messaggi

Inserito il - 22 febbraio 2013 : 09:09:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di STEFANIApcr Invia a STEFANIApcr un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok! Grazie Obarra1!
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