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annasic
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 19 marzo 2013 : 10:00:27
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Ciao ragazzi!
Avrei bisogno di un consiglio
Devo ralizzare una Real time PCR con le seguenti condizioni.
Volume finale 25microlitri contenenti 900nM di ogni primer, 200nM di sonda, 12,5microl di TaqUniversal Master Mix e 50ng di DNA.
Mi sono informata per l'acquisto di primers e probe e mi hanno proposto per i primer la taglia minima da 10000pmoli e per probe da 6000pmoli.
Secondo voi mi bastano per realizzare piu' reazioni?Ho fatto un po' di calcoli di conversione ma ho un po' di dubbi
Grazie
Anna
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chick80
Moderatore
Cittā: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2013 : 11:17:42
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Vuoi 900nM di primers, quindi 900 nmol/l ossia 900 pmol/ml.
Hai 10000 pmol quindi puoi fare 10000/900=11.1ml di reazioni. Ogni reazione sono 25ul, quindi puoi fare 11.1/0.025~=444 reazioni.
Per la sonda con lo stesso ragionamento troverai che puoi fare ~1200 reazioni. |
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annasic
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2013 : 12:22:20
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Grazie, avevo fatto un po' di confusione con le conversioni!
quindi mi conviene che poi mi preparo degli stock alle concentrazioni richieste per la reazione!? secondo te in quanto volume?
dovendo fare la reazione per la prima volta,e sapendo solo che deve essere in un volume finale di 25microlitri, potrebbe andar bene cosi?
5microl DNA (concentrato 50ng)
12,5 microl TaqUniversal Master MIx
1 microlitro Primers (900nM)
1 microlitro Probe (200nM)
5,5 microl H2O
Non so se devo considerare un volume maggiore per primers e probe!
Grazie ancora |
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Cittā: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 19 marzo 2013 : 18:50:10
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Ciao.
Nella tua "ricetta" manca un dato importante: la Concentrazione finale Cf di utilizzo dei primer e della sonda.
Es. Ci X Vi = Cf X Vf
Il Vi (quanto volume devo prendere dagli stock) = Cf X Vf (25 uL) / Ci (quella iniziale dei tuoi stock).
Attenzione alle unitā di misura nM e uM.
Se vuoi ti posso mandare un semplice foglio di calcolo in excel. |
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