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 Biologia Molecolare
 miniprep dopo site-directed mutagenesis
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enrica
Nuovo Arrivato




7 Messaggi

Inserito il - 26 settembre 2004 : 20:18:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di enrica Invia a enrica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti,
sono una studentessa di biologia.
Sto svolgendo una tesi che prevede la mutagenesi di singoli aminoacidi in una proteina e sto utilizzando il kit Quikchange site-directed mutagenesis della Stratagene. Il cDNA di questa proteina č stato clonato nel vettore pIRESpuro2, il quale contiene anche la resistenza all'ampicillina.
Il mio problema č il seguente: dopo la trasformazione dei batteri con i costrutti ottenuti dalla PCR di mutagenesi ( dopo digestione di 2 h con DpnI) sulle piastre di LB broth+ Amp ottengo delle colonie ( il che mi fa presumere che in esse ci siano i plasmidi mutati o perlomeno quelli parentali).
Quando poi faccio una miniprep ( con il kit della Sigma) di queste colonie, non ottengo assolutamente nulla, nč i plasmidi mutati, nč quelli parentali!
Com'č possibile che questi batteri, che di per sč, non sono resistenti all'Amp, riescano a sopravviverci in assenza di alcun plasmide contenente la resistenza?
Sono sicura che l'ampicillina funzioni e che le aliquote di batteri in uso non possano essere state contaminate in alcun modo.
Grazie in anticipo per qualsiasi suggerimento!

AleXo
Moderatore

OrniAle

Prov.: Estero
Cittą: San Francisco, California


1550 Messaggi

Inserito il - 27 settembre 2004 : 18:34:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AleXo  Invia a AleXo un messaggio AOL Invia a AleXo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
un integrazione del plasimde al cromosoma?mah....
Cmq, spassionatamente nonchč (purtroppo) x esperienza: mi sa ke fai prima a rifare tutto!!!!!!la biologia č cosģ no?!magari cambi qualke variabile, o metti un controllo in +.... Good luck!


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Ela
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 21 giugno 2006 : 15:08:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Ela Invia a Ela un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da enrica

Salve a tutti,
sono una studentessa di biologia.
Sto svolgendo una tesi che prevede la mutagenesi di singoli aminoacidi in una proteina e sto utilizzando il kit Quikchange site-directed mutagenesis della Stratagene. Il cDNA di questa proteina č stato clonato nel vettore pIRESpuro2, il quale contiene anche la resistenza all'ampicillina.
Il mio problema č il seguente: dopo la trasformazione dei batteri con i costrutti ottenuti dalla PCR di mutagenesi ( dopo digestione di 2 h con DpnI) sulle piastre di LB broth+ Amp ottengo delle colonie ( il che mi fa presumere che in esse ci siano i plasmidi mutati o perlomeno quelli parentali).
Quando poi faccio una miniprep ( con il kit della Sigma) di queste colonie, non ottengo assolutamente nulla, nč i plasmidi mutati, nč quelli parentali!
Com'č possibile che questi batteri, che di per sč, non sono resistenti all'Amp, riescano a sopravviverci in assenza di alcun plasmide contenente la resistenza?
Sono sicura che l'ampicillina funzioni e che le aliquote di batteri in uso non possano essere state contaminate in alcun modo.
Grazie in anticipo per qualsiasi suggerimento!

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Dionysos
Moderatore

D

Cittą: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 21 giugno 2006 : 19:45:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mhm..strano, il Quickchange dovrebbe essere
un metodo ad altissima resa (e lo posso confermare).

Io perņ ho usato un vettore con promotore virale T7...
e batteri del ceppo BL21(DE3), inducibili per la
T7 polimerasi tramite IPTG.

Credo faccia parte del protocollo quickchange...o sbaglio?

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontą e della libertą
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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