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Brad90
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 24 giugno 2013 : 11:40:42
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Buongiorno a tutti, come prima cosa volevo ringraziarvi per l'aiuto che date. Io ho un problema con l'EMSA: ho letto una vecchia discussione e ho capito molto bene il procedimento però, nel mio caso, per capire se effettivamente la proteina che lega il DNA è proprio quella di mio interesse, alla miscela di reazione sono stati aggiunti anticorpi-anti proteina di interesse. Se nn ho capito male, se è proprio la mia proteina a interagire, dovrei osservare un ulteriore rallentamento della corsa elettroforetica. In realtà, nell'immagine di un articolo, vedo più bande con intensità minore ed effettivamente sono un po' più rallentate. Cosa vuol dire??
Posso postare l'immagine?
Grazie mille
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 24 giugno 2013 : 23:36:25
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L'intensità minore dovrebbe esser correlata, a parità di proteina aggiunta tra campione senza e con anticorpo, alla presenza di più bande. La somma delle intensità delle varie bande dovrebbe raggiungere un valore prossimo a quella del campione senza anticorpo. Per dirla in un altro modo, le bande appaiono meno intense perché la quantita di proteina è distribuita su più bande anziché concentrarsi in una sola.
Oppure la presenza di un ab legato alla proteina riduce gli epitopi liberi per il suo rilevamento in WB, con diminuzione del segnale. Dovrei leggere l'articolo.
La presenza di più bande potrebbe indicare una diversa stechiometria di legame alla proeina da parte dell'anticorpo. Es del tutto fittizio e NON affidabile numericamente: una banda più alta in cui una proteina è stata legata da 5 molecole di anticorpo ed una più bassa in cui per ogni proteina si trovano associati solo 3 molecole.
Posta l'img opportunamente ridimensionata (risoluzione 640x480 dovrebbe fare il suo sporco lavoro) oppure il link al paper. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Brad90
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 25 giugno 2013 : 10:45:31
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Allegato:  Senza titolo.pdf
122,18 KB
L'immagine spero si veda: nella prima colonna non hanno usato anticorpi, nella seconda anticorpi contro la proteina di interesse e nella terza anticorpi aspecifici.
Ti riporto le righe dell'articolo che parlano di questo: "To establish that Skn7 protein is present within this complex, polyclonal antisera directed against Skn7p was added to the reaction mixture at the same time as the protein extract. A shift in the mobility of the complex was seen in reactions to which Skn7p antibody was added. In contrast, no shift in the mobility of the complex was seen in reactions to which a control antisera (anti-Gal11p) was added."
Ti ringrazio anticipatamente per la risposta. |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 25 giugno 2013 : 16:44:01
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| Considera anche che hanno utilizzato anticorpi policlonali, quindi è normale aspettarsi una certa eterogeneità di corsa nel campione trattato con questi. |
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gamsbip
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
11 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2013 : 20:03:49
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| mi riallaccio a questa discussione per chiarire dei miei dubbi,se qualcuno può farlo...non riesco a capire la differenza tra un EMSA ed un SOUTH-WESTERN...qualcuno può spiegarmela?con l'EMSA voglio verificare che una data seq di DNA venga legata da una proteina,e questo lo vedo mediante ritardo elettroforetico,ci sono...col south-western invece io dovrei risalire al fattore legante la data sequenza facendo uno screening di una libreria d'espressione(proteine) con una sonda a dsDna e verifico l'interazione DNA-proteina,ma coma faccio a sapere che proteina è??? |
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