Quanto è utile/interessante questa discussione:
| Autore |
Discussione |
|
|
OrkaLoca
Nuovo Arrivato
Città: MI
25 Messaggi |
 Inserito il - 29 settembre 2004 : 17:28:36
|
Qualche anima pia gentilmente mi spiegherebbe la differenza tra northern, southern, western blotting?
A me paion tutti la stessa cosa...il delirio di un folle @_@
Graaazie!
|
_*_OrkaLoca_*_ |
|
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2004 : 20:30:12
|
Diciamo che l'idea alla base (e quindi la tecnica usata) è la stessa per tutti e tre, ma servono per tre cose completamente diverse.
Il Southern blotting è stato il primo ad essere inventato, dal Dr. Southern e serve per l'analisi del DNA, il Northern serve per l'analisi dell'RNA e il Western per l'analisi delle proteine.
Con queste tecniche puoi ad es. vedere se un certo gene è presente in un campione (Southern), trascritto(Northern), o tradotto (Western).
Essenzialmente la tecnica consiste in questo:
1) Isoli ciò che vuoi analizzare (DNA, RNA o proteine)
2) Fai un'elettroforesi (per il Western si fa SDS-PAGE, gli altri non li ho mai fatti, ma credo si faccia un gel di poliacrilammide denaturante, cioè con urea), per separare i vari frammenti o le proteine.
3) Fai un blotting, cioè trasferisci il DNA, l'RNA o le proteine su una membrana di nitrocellulosa (per gli acidi nucleici, se non ricordo male, si può anche usare il nylon) che lega le proteine e gli acidi nucleici.
4) A questo punto sulla membrana hai le proteine o il DNA/RNA legato esattamente nelle stesse posizioni delle bande del gel.
Devi però saturare tutti gli altri NH2 della nitrocell. che non hanno legato nulla. Per fare questo usi albumina di siero bovino, nel caso del Western blotting e nel Northern/Southern se non ricordo male c'è un passaggio col calore (o con gli UV???) (sinceramente non mi ricordo!)
5) Puoi ora rilevare quello che vuoi.
Per gli acidi nucleici usi sonde radioattive (con P32 o trizio) complementari al gene di interesse.
Per le proteine usi anticorpi fluorescenti o che possano emettere luce con reazioni enzimatiche (solitamente si usa la HRP, horse radish peroxidase, che a contatto con un opportuno substrato libera un composto fluorescente). In realtà per motivi economici e di resa si usa un primo anticorpo contro la proteina di interesse e un secondo anti-anticorpo che lega il primo ed è marcato.
A questo punto vai in camera oscura, metti una lastra fotografica sulla membrana e lasci esporre per un tot. (da 5-10 secondi a 20-30 minuti per le proteine, varie ore x il radioattivo, soprattutto se trizio).
Sviluppi la lastra ed hai quindi una bellissima foto del tuo gel!
Oggigiorno, cmq, il Northern (ma anche il Southern oramai) non è più usato, per via dei lunghi tempi e dei materiali tossici da usare.
Puoi infatti ottenere gli stessi risultati, anche più precisi, con una PCR o una RT-PCR (o ancora meglio una real-time PCR!) in poche ore, rispetto ai 2-3 giorni dei vecchi metodi.
Se ti serve ancora qualche chiarimento chiedi pure!
bye
nICO |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
 |
|
|
OrkaLoca
Nuovo Arrivato
Città: MI
25 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2004 : 22:03:49
|
Grazie Nico *_*
mio salvatore!
Direi chiarissimo, molto di piu di come ce l'ho sulle dispense.
Domani ho l'esame, se me lo chiede so che dire *_*
Solo una cosa...sulle dispense mi da il southern fattibile con gel di agarosio e NaOH come agente denaturante. E'possibile?
|
_*_OrkaLoca_*_ |
|
|
|
AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2004 : 22:57:07
|
si il northern, e credo anke il southern si fa su gel d'agarosio...generalmente, l'elettroforesi per gli acidi nucleici si fa su gel d'agarosio; per gli acidi nucleici il gel di polyacri si usa solo quando si vuol dicriminare a livello di singola base,infatti venivan fatti per il sequenziamento, ma ora non si usano quasi mai...
il suothern benkè vekkissimo, è ancora molto usato non tanto nei lab di ricerca di base quanto in quelli di diangositka molecolare.
in bocca al lupo!! |
 |
|
|
|
OrkaLoca
Nuovo Arrivato
Città: MI
25 Messaggi |
 Inserito il - 30 settembre 2004 : 00:03:14
|
Ottimo, me lo annoto.
GRAZIE  |
_*_OrkaLoca_*_ |
|
|
|
atreliu
Amministratore
Prov.: Milano
Città: Milano
2484 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2004 : 11:40:34
|
Silviettina, c'è qualcosa anche nel sito: nella sezione Principi.
In bocca al lupo!!! |
MolecularLab.it - Animazioni, News, didattica & Community su bioinformatica, biologia molecolare ed ingegneria genetica.
BUONE REGOLE DEL FORUM:
- Prima di postare qualunque cosa leggere il Regolamento!
- Hai provato a cercare prima di postare il tuo problema? |
|
|
|
OrkaLoca
Nuovo Arrivato
Città: MI
25 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2004 : 20:46:59
|
alla fine non lo ha chiesto, ma per il metodo Sanger è grazie a voi se mi sono ricordata del gel di poliacrilammide *_*
La fregatura è che mi ero preparata per un orale e invece è arrivata e ha fatto lo scritto.
Voto infame ma almeno è passato...e ora mi manca un orale domani e...HO FINITOOOO!!!
me contentaaaa
papparappapa...chiwawa!...papparappapa...chiwawa! |
_*_OrkaLoca_*_ |
|
|
| |
Discussione |
|
|
|
Quanto è utile/interessante questa discussione:
| MolecularLab.it |
© 2003-18 MolecularLab.it |
|
|
|
help sui blotting
Didattica
