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Tag   clonaggio    Gateway    pENTR  Aggiungi Tag

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Luigi474
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1 Messaggi

Inserito il - 24 settembre 2013 : 11:03:53  Mostra Profilo Invia a Luigi474 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti volevo chiedervi se potevate chiarirmi alcuni dubbi sulla tecnica gateway. Leggendo il protocollo della invitrogen ho letto che ci sono più tecniche per far entrare il mio DNA di interesse nel vettore pENTR e che oltre ad usare i siti att e quindi fare tutti i passaggi mediante PCR mi sembra di aver capito che posso eventualmente clonare direttamente il mio DNA dentro il pENTR usando enzimi di restrizione e poi una volta clonato nel pENTR clonarlo nel pDEST è corretto oppure è necessario effettuare tutti i passaggi per ottenere il dna con le sequenze di ricombinazione? Grazie

midichloria
Nuovo Arrivato



75 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2013 : 12:16:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di midichloria Invia a midichloria un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Da quel che so io, devi per forza amplificare il tuo prodotto di PCR con primers che contengano i siti attB, in modo poi da fare una ricombinazione BP con un donor vector (avente i siti attP) e ottenere l'entry clone con i siti attL. Dalla ricombinazione tra il tuo entry clone (attL) e di un destination vector (attR) ottieni il tuo clone di espressione...
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2013 : 13:08:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì certo che si può!
Puoi benissimo inserire in un vettore pENTR un frammento con "clonaggio classico" perché tra i due siti attL c'è il MCS (multiple cloning site).

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