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Tag   esercizio PCR    primers  Aggiungi Tag

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ele56
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2013 : 12:11:39  Mostra Profilo Invia a ele56 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti,sono nuova e avrei bisogno del vostro aiuto!!!
Devo risolvere questo esercizio:
) Progetta due primer per amplificare mediante PCR l’intera sequenza sotto riportata e creare alle
estremità i siti di restrizione: EcoRI (all’inizio) e BamHI (alla fine), utili per il successivo clonaggio
dell’amplicone in un vettore. Scrivere i primer nella direzione 5’-3’. Calcolare inoltre la Tm dei
primer e stabilire le temperature da utilizzare nelle varie fasi della reazione di PCR (completare lo
schema sottoriportato).
Dimensione dell’amplicone: 750 bp
5’ATGAAACCAT TCTTCCTCAT TTCGCTGCTG GTCACGGTCT TCATGAGCCT
CATGTTGGCC ACCACCGCTC AACCCAGCCT TCCACTCAAC AACCGGCGGG
AACTTGCTGA GCATCCCCCA GTCAAGGGTA ACCCCCCAAA CACCGGCTAT
GCACTAGACT GGTGCAAATA CACAGCCGGA ATGCTATTTC AGTGGGATCT
CCCGACGTTT ATCAAGCATC GCGAGGCAAA CTTCAGCCTC GGACGGCTGA
CGTGGGACTG GTCGTCGGAT GGGTGTACCC ACGTCCCGGA CAATCCGGTT
GGCTTCCCAT TCAAGCCGGC GTGCCAGCGT CACGACTTTG GATACCGGAA
CTACCAGGTC CAATTCCATT TTACCCCGCG TGCTAGATGG AAGATTGACG
AGAATTTCCT CAAAGACATG AAATTCCAGT GCATAGGGCA CAACATCTTC
AATGCCTGCC ACTTCATGGC ACATGTTTAT CATTGGGGAG TCCGAACCTT
CTATAAAGGC CATGAGCAAT ACCGTGAGAG TGAGCCGTCT CACAAGATGA
TGGACACGAT GGTCGCTTCT GAATCGTCGG ACGTGTTTGA TGGGATGGAC
GCCGATGAAG CGAGGGACGC TCTCAATCCA TATCTTTCTG AAGAGAAGAC
CAAAGAGTAC TACGATCGTG CCCTAGCGCG TTACAACAAG TGTGTTGAGG AAGCCATGGC GCAAGGCATT GACCTTCAGA AATACTGGGC CGCTTTTTAG 3’
lo schema mi chiede di completare la temepratua a:
3',30'',30'',1'00'' e 10'!
vi prego aiutatemi!!!!

midichloria
Nuovo Arrivato



75 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2013 : 12:26:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di midichloria Invia a midichloria un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Puoi usare questi programmi per aiutarti.....
http://molbiol-tools.ca/PCR.htm
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

Ti aiuta a trovare dei primer che si appaiano completamente alla sequenza ma poi i siti di restrizione per gli enzimi però li devi inserire tu. Successivamente verifica che non ci siano problemi di formazione forcine, appaiamento tra i due primers, ecc :)
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2013 : 12:57:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh se è un esercizio di un corso universitario che è stato dato apposta per capire come si costruiscono i primers, non bisogna usare programmi (a meno che non sia un corso di Bioinformatica) ma farlo manualmente, altrimenti che senso avrebbe l'esercizio?

ele56 a lezione ti avranno sicuramente fornito tutti gli elementi per risolvere l'esercizio, quello che possiamo fare qui è darti una mano a risolverlo, ma ci devi mettere del tuo!
Innanzitutto devi andarti a vedere quali sono le caratteristiche che devono avere i primers, poi iniziare a scrivere delle sequenze di primers che vadano bene per amplificare quel frammento e poi inserirci le sequenze degli enzimi di restrizione richiesti.
Inizia a scrivere il tuo ragionamento...

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ele56
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2013 : 13:34:35  Mostra Profilo Invia a ele56 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ho iniziato a svolgere l'esercizio e sono riuscita a costruire i primer.ho un dubbio però;per inserire la sequenze degli enzimi di resrtizione devo precedere con alcune sequenze o posso direttamente scrivere la sequenza dell'enzima?e poi la tm la calcolo prima o dopo aver aggiunto gli enzimi di restrizione?
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ele56
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2013 : 13:36:17  Mostra Profilo Invia a ele56 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ho iniziato a svolgere l'esercizio e sono riuscita a costruire i primer.ho un dubbio però;per inserire la sequenze degli enzimi di resrtizione devo precedere con alcune sequenze o posso direttamente scrivere la sequenza dell'enzima?e poi la tm la calcolo prima o dopo aver aggiunto gli enzimi di restrizione?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2013 : 17:59:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Devi mettere prima 2-6 basi iniziali, poi la sequenza del sito per l'enzima infine la sequenza specifica del primer.
Le basi iniziali servono per far "sedere" l'enzima di restrizione sulla sequenza altrimenti se il sito di riconoscimento è all'estremità l'enzima non riesce a tagliare.
Questo è quello che si fa quando si fanno i clonaggi, poi non so se questa cosa vi è stata detta o se vogliono semplicemente che scriviate la sequenza del sito di restrizione.

La Tm è quella dei primers senza il sito di restrizione perché è quello che si legherà all'inizio alla sequenza da amplificare, solo nei cicli successivi si appaierà anche la "codina" con il sito di restrizione.
(N.B. spesso però praticamente si considerano entrambe le Tm, si inizia la PCR per i primi cicli con la Ta più bassa e poi si alza, ma questo giusto per conoscenza, non credo sia richiesto per l'esercizio)
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GaiaXX
Nuovo Arrivato



7 Messaggi

Inserito il - 18 febbraio 2015 : 16:24:05  Mostra Profilo Invia a GaiaXX un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
anche io ho questo esercizio. sono riuscita a scollegato, ma non capisco proprio la finalità del dato riguardante la dimensione dell'amplicone!! per il tempo di reazione?? boh!! poi un altra osservazione, le 2-6 basi che devo aggiungere inizialmente, per l'inserimento alle estremità,le scelgo a mio piacimento vero? perchè se utilizzassi le estreme della sequenza poi sfalserei il frame di lettura giusto?
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GaiaXX
Nuovo Arrivato



7 Messaggi

Inserito il - 18 febbraio 2015 : 16:30:34  Mostra Profilo Invia a GaiaXX un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
scollegato sta per "risolverlo" !!!
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