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joleee80
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Prov.: Napoli
CittÓ: napoli


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Inserito il - 20 febbraio 2007 : 12:34:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di joleee80 Invia a joleee80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie ai lettori e a chi mi ha risposto.
ho giÓ clonato la proteina intera,ora essendo interessata alla porzione C terminale volevo clonare solo questa regione magari con un His-tag all'N-terminale.
il vettore che dovrei utilizzare Ŕ un pQE30 fornito dalla quiagen,la sequenza che vorrei inserire Ŕ di 303bp (la sequenza completa della proteina Ŕ circa 800 bp), e come enz di restrizione avevo pensato a BamHI e HindIII.
ci˛ che mi rende perplessa Ŕ di "azzeccare" il frame e di limitare il numero di a.a. tra l'his-tag e il frammento di interesse.

Ci˛ che mi nutre .......mi distrugge....

barbapapÓ
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 20 febbraio 2007 : 14:45:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di barbapapÓ Invia a barbapapÓ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il mio consiglio Ŕ questo:

amplifica la sequenza di 303 bp che ti interessa clonare nel vettore pQE, con due primers che ti farai sintetizzare ad hoc e con queste caratteristiche:
la seq in 5' di ciascun primer conterrÓ un sito di restrizione e la seq in 3' sarÓ complementare alla regione che vuoi clonare.
Mi spiego meglio: il primer forward avrÓ nella regione in 5' il sito BamH1/HindIII e nella regione 3' una seq complementare alla seq da clonare; il primer reverse avrÓ in 5' il sito di restrizione per HindIII/BamH1 e in 3' la seq complementare.

Esegui una PCR e purifica l'amplificato da gel.
L'amplificato (lineare) avrÓ i due siti di restrizione (da digerire) alle due estremitÓ.
OK?
Digerisci l'amplificato con i due enzimi di restrizione e quindi clonalo nel pQE precedentemente digerito con i due enzimi.

Cosa fare per il frame?
Verifica quanti nucleotidi ti Ŕ indispensabile aggiungere nella sequenza del primer forward tra il sito di restrizione e il frame della tua proteina e verifica che i codoni che si generano siano codificanti e non codoni di stop. Meglio se codificano per aa neutri.

Spero di essermi spiegato bene.

In bocca al lupo,
fammi sapere
ciao


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joleee80
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Prov.: Napoli
CittÓ: napoli


24 Messaggi

Inserito il - 22 febbraio 2007 : 10:59:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di joleee80 Invia a joleee80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Carissimo barbapapÓ ti ringrazio per la risposta.ti allego anche la sequenza che devo amplificare con i 2 primer che penso di utilizzare. che ne pensi??
Grazie ancora dell'aiuto!!!!

Allegato: PRIMER PROT DI FUSIONE.doc
24,57 KB

Ci˛ che mi nutre .......mi distrugge....
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barbapapÓ
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10 Messaggi

Inserito il - 22 febbraio 2007 : 12:36:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di barbapapÓ Invia a barbapapÓ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao

Secondo me dovresti rivedere le sequenze prestando attenzione alle Temperature di melting che ottieni. Mi spiego meglio.

Quando progetti il protocollo di PCR, devi considerare che durante i primi cicli si "annealeranno" solo le seq a valle dei siti di restrizione. Le Tm per queste porzioni di seq sono:
primer 1: 50.81░C
primer 2: 48.27░C
Il delta Ŕ di 2.54░, direi che pu˛ andare.

Per quanto riguarda il frame, non sono riuscita a trovare la seq dei vettori pQE. Se non ricordo male il codone di inizio + il tag di HIS sta sul vettore... controlla che l'inserzione non generi uno shift del frame di lettura.
Il codone di stop l'hai inserito tu....

Quindi per me pu˛ andare.

Fammi sapere se tutto funziona!

Ciao



Nei cicli successivi per˛ la Tm sarÓ relativa all'intera seq. dei primers. E qui nascono un po' di problemi.
Con le tue seq, le Tm sono:
primer 1: 71.53░C
primer 2: 65.40░C
Il delta Ŕ di 6.13░C, direi un po' alto.

PerchŔ non provi a sostituire i primi 3 nucleotidi del primer 1 forward con A e T?

Se CGC diventano AAT, la Tm dell'intero primer 1 forward scende a 65.25░C. Perfetta!







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barbapapÓ
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 22 febbraio 2007 : 12:38:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di barbapapÓ Invia a barbapapÓ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ccusa... c'Ŕ stata un'inversione nel mio testo. Ecco il testo corretto:

Ciao

Secondo me dovresti rivedere le sequenze prestando attenzione alle Temperature di melting che ottieni. Mi spiego meglio.

Quando progetti il protocollo di PCR, devi considerare che durante i primi cicli si "annealeranno" solo le seq a valle dei siti di restrizione. Le Tm per queste porzioni di seq sono:
primer 1: 50.81░C
primer 2: 48.27░C
Il delta Ŕ di 2.54░, direi che pu˛ andare.

Nei cicli successivi per˛ la Tm sarÓ relativa all'intera seq. dei primers. E qui nascono un po' di problemi.
Con le tue seq, le Tm sono:
primer 1: 71.53░C
primer 2: 65.40░C
Il delta Ŕ di 6.13░C, direi un po' alto.

PerchŔ non provi a sostituire i primi 3 nucleotidi del primer 1 forward con A e T?

Se CGC diventano AAT, la Tm dell'intero primer 1 forward scende a 65.25░C. Perfetta!

Per quanto riguarda il frame, non sono riuscita a trovare la seq dei vettori pQE. Se non ricordo male il codone di inizio + il tag di HIS sta sul vettore... controlla che l'inserzione non generi uno shift del frame di lettura.
Il codone di stop l'hai inserito tu....

Quindi per me pu˛ andare.

Fammi sapere se tutto funziona!

Ciao
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joleee80
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Prov.: Napoli
CittÓ: napoli


24 Messaggi

Inserito il - 22 febbraio 2007 : 14:35:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di joleee80 Invia a joleee80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Caro barbapapÓ,
ho di nuovo alcuni problemi...
1 in effetti dal programma di predizione oligo 4 i miei primer non vanno bene
2 non posso cambiare CGC in ATT nel primer forward perchŔ mi serve d'appoggio per l'enzima di restrizione
3 mi dici come hai calcolato il Tm perchŔ in base alla formula che ho applicato 4░C per G e C e 2░C per A e T mi trovo che il Tm dei primer Ŕ 54░C.
fammi sapere!!!!a presto

Ci˛ che mi nutre .......mi distrugge....
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barbapapÓ
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Inserito il - 22 febbraio 2007 : 16:16:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di barbapapÓ Invia a barbapapÓ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La formula che usi per calcolare il Tm Ŕ un po' grossolana (scusami il termine).

Questa Ŕ sicuramente pi¨ affidabile:

Tm = 69.3░C + 0.41 * (%GC) - 650/n

dove:
(%GC) Ŕ il valore % di G o C (es.: 53 e non 0.53, attenzione!)
n Ŕ la lunghezza del primer

Altrimenti esistono calcolatori on-line (molto pi¨ precisi), come per esempio quello che trovi a questo link:

https://www2.appliedbiosystems.com/support/apptech/#pcr_app

Immaginavo che la sostituzione dei nt cosý vicini al sito di restrizione non fosse facile...

Ho cercato anche altre soluzioni (tipo: aggiungere nt PRIMA del CGC) ma non ho trovato soluzioni valide.

Non saprei....

Dimmi: la tua proteina deve per qualche ragione particolare cominciare dal tct ??? Non si pu˛ spostare prima o dopo di qualche codone???
Altrimenti bisognerebbe trovare un altro sito di restrizione pi¨ adatto.

C'Ŕ nessuno che ha altre idee????

ciao

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joleee80
Nuovo Arrivato


Prov.: Napoli
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24 Messaggi

Inserito il - 22 febbraio 2007 : 17:38:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di joleee80 Invia a joleee80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
cara barbapapÓ,
vorrei mantenere il sito di restrizione di bamHI per˛ non sono vincolata sulla tripletta di inizio della proteina, poichŔ mi interessa la regione C terminale.
avevo scelto quella zona perchŔ per motivi di stabilitÓ non posso clonare un frammento pi¨ piccolo di 10KDa e inoltre nella zona da me scelta non si formano strutture secondarie.per˛ forse devo cambiare.
ti invio la seq. genica della proteina intera (tra l'altro giÓ clonata).
ciaooo

Allegato: Seq gene SsMTAPII.doc
35,83 KB

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