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 Biologia Molecolare
 La prova della semidiscontinuitÓ della replicazione del DNA
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Gr÷n
Utente Junior



220 Messaggi

Inserito il - 28 ottobre 2013 : 20:41:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gr÷n Invia a Gr÷n un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti,

ho una curiositÓ da porvi. Come senz'altro giÓ sapete, il contributo di Okazaki&collaboratori Ŕ stato cruciale per svelare l'arcano dell'andamento discontinuo della replicazione del DNA.

Tuttavia, non Ŕ stato lui a porre l'accento sul carattere SEMI-discontinuo del suddetto processo!

Son stati infatti necessari altri anni di ricerche, altri esperimenti - in particolare uno, condotto sul Polioma Virus, che hanno sciolto ogni dubbio al proposito.

_

Ecco, io vorrei trovare un articolo che tratti questo argomento in maniera relativamente dettagliata.

Ho provato a cercare su internet ma non ho trovato nulla di chiaro nÚ di completo.

In breve, si tratta di un esperimento in cui si fanno crescere questi virus su un terreno contenente azoto pesante (azoto 15, per intenderci).

L'esperimento prevede una corsa elettroforetica, la separazione dei filamenti e l'ibridazione di questi con frammenti. SarÓ l'ibridazione a decretare la prova della semidiscontinuitÓ.

Purtroppo non dispongo del protocollo completo e quindi ho capito la procedura solo per metÓ.

Se qualcuno di voi avesse una qualche idea circa l'argomento - o sapesse dove reperire un articolo (anche in inglese!) al riguardo, ne sarei molto felice! :)

_

Un saluto a tutti e grazie dell'attenzione!

RM
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 29 ottobre 2013 : 10:38:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

http://www.nature.com/scitable/topicpage/semi-conservative-dna-replication-meselson-and-stahl-421


http://basic.shsmu.edu.cn/jpkc/cellbiota/resource/exper/5.pdf

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Gr÷n
Utente Junior



220 Messaggi

Inserito il - 29 ottobre 2013 : 14:20:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gr÷n Invia a Gr÷n un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
RM: ti ringrazio molto per il tuo contributo ma.. Questi che mi hai fornito son esperimenti circa la semi-conservativitÓ, condotti da Meselson-Stahl.

..Mentre io ho bisogno di una speiegazione inerente alla semi-discontinuitÓ! :)

_

Vi ricordo che la discontinuitÓ in generale Ŕ stata testimoniata dalla serie di esperimenti di Okazaki. Di cui giÓ dispongo di sufficiente materiale.

Quello che mi manca Ŕ un articolo circa l'esperimento che ha provato la SEMIdiscontinuitÓ (non la discontinuitÓ!) condotto con il virus del polioma. :)

Rinnovo la mia richiesta d'aiuto e vi ringrazio nuovamente per l'attenzione!
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Gr÷n
Utente Junior



220 Messaggi

Inserito il - 01 novembre 2013 : 20:12:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gr÷n Invia a Gr÷n un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho come l'impressione che il titolo di questa discussione abbia suscitato un tremendo scalpore, a giudicare dal numero di visualizzazioni xD ma che nessuno abbia poi sentito la necessitÓ di esprimersi.

La buona notizia Ŕ che ho risolto il dubbio :) Siccome mi son sempre trovato cosý bene, qui, mi fa piacere condividerlo con voi.

_

L'esperimento prevede l'utilizzo di DNA di virus del polioma, un virus a DNA circolare, simile ad un plasmide. Comodo lavorarci, perchÚ non ha un'estensione eccessiva in termini di bp.

I virus son fatti crescere su un terreno in presenza di un isotopo pesante del carbonio in modo tale che ciascuna molecola di DNA sia formata da uno strand leggero ed uno strand complementare pesante.

Si estrae il DNA e lo si sottopone a tagli con enzimi di restrizione. DopodichÚ, la mistura contenente il DNA spezzettato viene caricata su un gel d'agarosio, per effettuare un' elettroforesi tipica.

Alcuni dei frammenti risulteranno pi¨ lunghi degli altri - cioŔ, avranno un maggior peso molecolare. Ricordate infatti che in queste condizioni, stiamo separando i frammenti in base al peso molecolare! E quindi, andr˛ a prelevare questi frammenti pi¨ grossi - diciamo, per comoditÓ, che preleviamo due frazioni di DNA, le due frazioni "pi¨ lente".

Questo DNA lo carichiamo su UN ALTRO gel - ma questa volta, in condizioni denaturanti. Quindi, caricheremo su una corsia del gel il DNA relativo al primo frammento - e sull'altra corsia, il DNA relativo al secondo frammento. Le condizioni denaturanti assicureranno una separazione degli strands complementari - con quelli marcati con l'isotopo pesante un po' pi¨ "lenti" nella migrazione elettroforetica.

A questo punto, subentra la terza fase: bisogna procurarsi i frammenti di okazaki specifici della replicazione del genoma di questo virus ed utilizzarli come sonde. Per farlo, Ŕ sufficiente indurre (a parte, ovviamente!) la replicazione del virus in presenza di dNTP marcati. I filamenti di neosintesi saranno inevitabilmente marcati e quindi fungeranno da "probes"..

Si pu˛ quindi provare ad effettuare l'ibridazione dei frammenti di Okazaki marcati con.. il DNA separato e denaturato, sottoposto ad elettroforesi prima.

Ebbene, si vedrÓ che i frammenti di Okazaki ibrideranno SOLO con uno dei due filamenti (ex. quello leggero) del primo sample - e SOLO con uno dei due filamenti (l'altro, quindi quello pesante) del secondo sample.

Questo Ŕ in accordo con la semidiscontinuitÓ.

E soprattutto con il fatto che, nella bolla di replicazione, ci sia questa situazione qui:



..e cioŔ, che rispetto all'origine di replicazione (che sarebbe il "centro" della bolla) la replicazione procede in maniera discontinua da un lato e continua dall'altro lato dello stesso filamento.

In altre parole, si parla di semi-discontinuitÓ in un contesto di bidirezionalitÓ.

E tutto quadra.

:) Spero possa tornare utile a qualcuno di voi!

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chick80
Moderatore

DNA

CittÓ: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 02 novembre 2013 : 09:44:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
eheh, in effetti avevo notato il tuo msg e volevo cercare i papers originali, ma non ho ancora avuto tempo...

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Gr÷n
Utente Junior



220 Messaggi

Inserito il - 02 novembre 2013 : 12:13:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gr÷n Invia a Gr÷n un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
:D Grazie della partecipazione!

Il dubbio Ŕ risolto, ma.. se dovessi avere del tempo libero e trovare qualche articolo originale al riguardo (perchÚ davvero, non riesco a trovare proprio nulla nÚ su libri nÚ altrove!) mi fa piacere.

Un saluto
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