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Nicole8989
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
 Inserito il - 22 novembre 2013 : 22:44:19
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Salve a tutti! Ho dei problemi con alcuni western blot e non riesco a capire la causa! Quindi volevo farvi alcune domande.
Utilizzo la membrana PVDF. Cosa succede se si asciuga? Ho notato oggi che prima di ricoprirla con la soluzione per la detection era diventata opaca. Vuol dire che si è seccata o è normale?
Dopo quanto tempo una membrana è "vecchia"? Ho una membrana datata 12.11.13 conservata in TBST a 4°C su cui sono riuscita a fare la detection di 4 proteine. Oggi ho provato un altro anticorpo ma senza risultato (sono sicura di diluizione e qualità dell'anticorpo perchè è ampiamente usato in lab). E' possibile che in 10 giorni le proteine siano state "lavate" via? (il marker è ancora presente, e nella detection si vedono le bande relative alle altre quattro proteine già testate).
Mi rendo conto che possono sembrare domande stupide, ma sono una novellina in questo campo e non riesco a capire quale sia il problema :(
Grazie a tutti!
Nicole
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 27 novembre 2013 : 09:27:40
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Quanto c'è di mezzo il glorioso western, non esistono mai domande stupide! 
La membrana si può conservare a 4°C o anche a -20°C.
Per esperienza, la conservazione a 4°C in PBS-tween (io usavo questo buffer) non l'ho mai prolungata per più di 2 giorni (praticamente un week-end). O meglio, abbiamo provato per 1 e 2 settimane, ma non è uscito niente: filtri pulitissimi! Per conservazioni prolungate, ti conviene disidratarli.
Riguardo il primo punto, non ho ben capito la situazione. In genere è meglio non farla asciugare troppo, perché poi ci vuole un po' di più per reidratarla. Ma nel tuo caso, se ho capito bene, ci troviamo nella fase pre-detection. Quindi, togli l'ultimo lavaggio, fai sgocciolare la membrana e le aggiungi l'ECL, giusto?
E' abbastanza difficile che in queste fasi, la membrana possa arrivare ad asciugarsi così tanto. |
 
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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