Identificazione gene malattia e chromosome walking

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gamabunta313
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8 Messaggi

Inserito il - 03 gennaio 2014 : 10:15:37

Ciao a tutti, perdonatemi in anticipo se vi tedio con il mio post durante le vacanze tuttavia non so pi� cosa fare con questo chromosome walking(ho trovato mille spiegazioni e post all'interno del forum , ma le ho trovate tutte piuttosto scolastiche mentre a me serviva una spiegazione pratica del metodo, pi� legata ad una vera e propria analisi). Tramite analisi di linkage ho determinato che dei marker genici sono in linkage disequilibrium con il mio gene malattia (Lod score ecc);
-Digerisco parzialmente il mio DNA (se voglio usare lambda utilizzo EcoR1 cos� ho sticky complementari alle estremit� cos) ed eseguo packaging in vitro in modo da impaccare le mie porzioni di DNA+estremit� lambda nei capsidi,->infetto coli ed ottengo le placche(ciascuna contenente solo cloni con integrato lo stesso frammento)
- Utilizzo una sonda radioattiva(per il mio marker forse?), con filtro di nitrocellulosa individuo la placca in cui la sonda ha ibridato ed isolo ed amplifico il mio fago infettando coli ;
purifico e sequenzio ed utilizzo un'altra sonda pi�"prossimale"(passatemi il termine) rispetto al mio gene malattia e rifaccio gli altri step, muovendomi sul cromosoma: a questo punto � buio perche la proff ha terminato dicendo che quando si trova una ORF mi fermo . E' corretto quello che ho detto ? E nel frattempo non potrei trovare altre ORF che non "appartengono" al mio genen malattia? grazie a tutti in anticipo