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 Identificazione gene malattia e chromosome walking
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gamabunta313
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8 Messaggi

Inserito il - 03 gennaio 2014 : 10:15:37  Mostra Profilo Invia a gamabunta313 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, perdonatemi in anticipo se vi tedio con il mio post durante le vacanze tuttavia non so più cosa fare con questo chromosome walking(ho trovato mille spiegazioni e post all'interno del forum , ma le ho trovate tutte piuttosto scolastiche mentre a me serviva una spiegazione pratica del metodo, più legata ad una vera e propria analisi). Tramite analisi di linkage ho determinato che dei marker genici sono in linkage disequilibrium con il mio gene malattia (Lod score ecc);
-Digerisco parzialmente il mio DNA (se voglio usare lambda utilizzo EcoR1 così ho sticky complementari alle estremità cos) ed eseguo packaging in vitro in modo da impaccare le mie porzioni di DNA+estremità lambda nei capsidi,->infetto coli ed ottengo le placche(ciascuna contenente solo cloni con integrato lo stesso frammento)
- Utilizzo una sonda radioattiva(per il mio marker forse?), con filtro di nitrocellulosa individuo la placca in cui la sonda ha ibridato ed isolo ed amplifico il mio fago infettando coli ;
purifico e sequenzio ed utilizzo un'altra sonda più"prossimale"(passatemi il termine) rispetto al mio gene malattia e rifaccio gli altri step, muovendomi sul cromosoma: a questo punto è buio perche la proff ha terminato dicendo che quando si trova una ORF mi fermo . E' corretto quello che ho detto ? E nel frattempo non potrei trovare altre ORF che non "appartengono" al mio genen malattia? grazie a tutti in anticipo
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