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 Come fare per risolvere questo esercizio di microbiologia?
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Autore Discussione  

laroc
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8 Messaggi

Inserito il - 14 gennaio 2014 : 12:53:09  Mostra Profilo Invia a laroc un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se è possibile potreste aiutarmi a capire come risolvere questo esercizio d'esame?
In un esperimento di trasformazione di E. coli aggiungi un’aliquota di plasmide pBCSK (CmR) a 200 microlitri di cellule competenti; dopo lo shock termico aggiungi 800 microlitri di SOC e infine piastri 100 microlitri.
Sapendo che l’efficienza di trasformazione attesa è di 1x10^6 trasformanti/microgrammi di DNA, che quantità di plasmide devi aggiungere alle cellule competenti per avere circa 100 colonie su piastra?
Su quale terreno piastri la trasformazione?
Grazie in anticipo.

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 17 gennaio 2014 : 17:34:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Prova a scriverci il tuo ragionamento, anche se sbagliato, così ci ragioniamo insieme.
Magari dai anche una lettura a queste pagine: http://www.molecularlab.it/principi/calcoli-laboratorio/

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laroc
Nuovo Arrivato



8 Messaggi

Inserito il - 17 gennaio 2014 : 18:17:01  Mostra Profilo Invia a laroc un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
OK! io ho pensato di fare questo calcolo: 100 colonie/ 1x10^6 trasformanti/microgrammi di DNA = 1x10^-4 microgrammi di DNA ossia 0,0001 microgrammi. E per il terreno da usare: TSA + CmR

E' giusto o sbagliato ragionare così????
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8397 Messaggi

Inserito il - 17 gennaio 2014 : 18:48:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
E il volume?
E' la stessa cosa se semini 100 microlitri, 50 microlitri o 500 microlitri? Ti aspetti lo stesso numero di colonie?

Per il terreno, non so che terreni di abbiamo detto a lezione di solito si usa LB, ma TSA presumo vada bene uguale.
Ma "CmR" per cosa sta secondo te?
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laroc
Nuovo Arrivato



8 Messaggi

Inserito il - 17 gennaio 2014 : 19:08:41  Mostra Profilo Invia a laroc un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non sta per antibiotico cloramfenicolo che devo aggiungere al TSA?
E per il numero di colonie dal volume piastrato sinceramente non so come fare i calcoli. Perché da 1000 microlitro, ne piastro 100 microlitri, ma i 200 microlitri che compongono l'1ml da come ho capito vengono diluiti a 20 microlitri?
e come li conto nel numero di colonie?
grazie
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8397 Messaggi

Inserito il - 17 gennaio 2014 : 19:38:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da laroc

Non sta per antibiotico cloramfenicolo che devo aggiungere al TSA?

Non esattamente! La "R" per cosa sta?


Citazione:
E per il numero di colonie dal volume piastrato sinceramente non so come fare i calcoli. Perché da 1000 microlitro, ne piastro 100 microlitri, ma i 200 microlitri che compongono l'1ml da come ho capito vengono diluiti a 20 microlitri?
e come li conto nel numero di colonie?

Ben non importa che i batteri inizialmente fossero in 200ul, ma il volume finale. Tu hai 1ml e di questo ne piastri 100ul (1/10 quindi), quindi su piastra si formeranno 100 colonie che derivano dai batteri che hai nei 100 ul, se invece ne avessi piastrati 500ul quante colonie ti saresti aspettata? e se avessi piastrato tutto 1 ml?

(N.B. in ogni caso anche se considerassi i batteri, da 200 ul a 20 ul sarebbe comunque un rapporto 1/10!)
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laroc
Nuovo Arrivato



8 Messaggi

Inserito il - 18 gennaio 2014 : 00:50:01  Mostra Profilo Invia a laroc un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scritto da MolecularLab Mobile

Ma non è la sigla che indica che il plasmide è resistente all' antibiotico cloramfenicolo?
Ora, se avessi piastrato 1 ml presumo che serebbe stato inutile cercar di contare colonie in piastra, giusto? Con 500 ul forse 500 colonie? Non ci sto capendo più niente! Uso un libro dove questi argomenti, chiamiamoli pratici, non li spiega affatto. Però, vista la disponibilità nel rispondere, io vorrei capire la relazione tra il numero di colonie, il volume, quei 200 ul di cellule competenti con i ug di plasmide. Scusa se scoccio, ma non so a chi altri chiedere, per capire come devo ragionare per risolvere questa tipologia di quesito!
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 18 gennaio 2014 : 10:37:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Ma non è la sigla che indica che il plasmide è resistente all' antibiotico cloramfenicolo?


NO! La sigla indica che il plasmide CONFERISCE LA RESISTENZA al cloramfenicolo. Il plasmide di per sè se ne frega se c'è del cloramfenicolo in giro! Sono i batteri che schiattano!

Ad ogni modo quello che Silvia stava cercando di suggerirti è che il plasmide è CmR perchè garantisce la Resisenza al cloramfenicolo. Il cloramfenicolo, quindi, non si indica con CmR ma semplicemente con Cm (o spesso CHL).

Citazione:
Ora, se avessi piastrato 1 ml presumo che serebbe stato inutile cercar di contare colonie in piastra, giusto? Con 500 ul forse 500 colonie? Non ci sto capendo più niente!

Esatto. Ipotizzando che non ci siano problemi di spazio/nutrienti, che la tua aliquota iniziale fosse omogenea etc. dovresti avere rispettivamente ~1000 e ~500 colonie.


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laroc
Nuovo Arrivato



8 Messaggi

Inserito il - 18 gennaio 2014 : 12:26:37  Mostra Profilo Invia a laroc un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok grazie del chiarimento!
Allora, se ho capito... tenendo conto che io presumo dal testo di non sapere quanti ng di plasmide aggiungo ai 200 ul di cellule competenti, ma solo che piastro 100 ul del 1 ml, l'esercizio dovrebbe venire:
ug DNA per 100 ul piastrati = Nt/Ef.trasf
calcolo:
100 colonie/ 1x10^6 trasformanti/microgrammi di DNA = 1x10^-4 ovvere 0,0001 ug o 0,1 ng di DNA per 100 ul piastrati.

terreno: TSA Cm

E' giusto?????
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 20 gennaio 2014 : 19:43:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma scusa l'hai risolto esattamente uguale a prima!

Citazione:
Messaggio inserito da laroc

OK! io ho pensato di fare questo calcolo: 100 colonie/ 1x10^6 trasformanti/microgrammi di DNA = 1x10^-4 microgrammi di DNA ossia 0,0001 microgrammi.


Citazione:
Messaggio inserito da laroc

Allora, se ho capito... tenendo conto che io presumo dal testo di non sapere quanti ng di plasmide aggiungo ai 200 ul di cellule competenti, ma solo che piastro 100 ul del 1 ml, l'esercizio dovrebbe venire:
ug DNA per 100 ul piastrati = Nt/Ef.trasf
calcolo:
100 colonie/ 1x10^6 trasformanti/microgrammi di DNA = 1x10^-4 ovvere 0,0001 ug o 0,1 ng di DNA per 100 ul piastrati.


Ti ha anche suggerito chick80 che su 1ml (ovvero il tuo campione hai 1000 colonie!)
Tu devi calcolare i ng di DNA che devi mettere nei tuoi batteri.
"ug DNA per 100 ul piastrati" non è una cosa che abbia senso!
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laroc
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8 Messaggi

Inserito il - 21 gennaio 2014 : 10:24:10  Mostra Profilo Invia a laroc un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Credo vivamente che il suggerimento, dalle spiegazioni, non riesco a coglierlo!

Se io devo determinare la quantità di plasmide pBCSK (CmR) presumo che siano necessari alcuni dati e cioè: o 1) la quantità di plasmide totale usata ad inizio esperimento ( che nel testo manca!) o 2) la concentrazione di pBCSK (CmR) (di cui non c'è accennato nulla!) o 3) il volume in ul del plasmide ( ignoto anch'esso!).
Io conosco solo la frazione del plasmide usato: volume trasferito (100 ul) / volume totale + pBCSK ( 1ml) ---> la frazione è 1/10 = 0,1!

teoricamente per calcolare la quantità di pBCSK trasferita su piastra ( di cui nel testo non conosco il valore) dovrei moltiplicare la frazione 0,1 x la quantità totale di plasmide usato che dal testo dell'esercizio non ho.

l'efficienza di trasformazione = numero totale colonie su piastra/ quantità di DNA trasferita in piastra che non ho, perché ho solo la frazione (0,1)
sostituendo i valori:
1*10^6= 100/0,1 * X allora X dovrebbe venire= 100/10^6*0,1 = 0,001 ug o 1ng
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8397 Messaggi

Inserito il - 21 gennaio 2014 : 19:13:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da laroc

Credo vivamente che il suggerimento, dalle spiegazioni, non riesco a coglierlo!

Se io devo determinare la quantità di plasmide pBCSK (CmR) presumo che siano necessari alcuni dati e cioè: o 1) la quantità di plasmide totale usata ad inizio esperimento ( che nel testo manca!) o 2) la concentrazione di pBCSK (CmR) (di cui non c'è accennato nulla!) o 3) il volume in ul del plasmide ( ignoto anch'esso!).
Io conosco solo la frazione del plasmide usato: volume trasferito (100 ul) / volume totale + pBCSK ( 1ml) ---> la frazione è 1/10 = 0,1!

teoricamente per calcolare la quantità di pBCSK trasferita su piastra ( di cui nel testo non conosco il valore) dovrei moltiplicare la frazione 0,1 x la quantità totale di plasmide usato che dal testo dell'esercizio non ho.




La quantità di plasmide espressa in ug che devi utilizzare è quello che ti chiede l'esercizio!
Se ti chiedesse quanti microlitri di plasmide devi usare allora ok dovresti sapere quanto è concentrato, se poi ti desse già il volume in microlitri che devi usare e la concentrazione del plasmide...beh allora non avresti neanche conti da fare ti darebbe già la soluzione!


Citazione:
Messaggio inserito da laroc

l'efficienza di trasformazione = numero totale colonie su piastra/ quantità di DNA trasferita in piastra che non ho, perché ho solo la frazione (0,1)



Questa da dove viene fuori?
cosa c'entra la piastra?
l'efficienza di trasformazione è (come ti dice anche il testo):
n° trasformanti/microgrammi di DNA
e dipende dai batteri che hai, non dalla quantità che piastri!

Usando X ug (che è il numero che devi trovare) e piastrando 100 ul otterrai 100 colonie, ma così facendo hai piastrato 1/10 del volume totale che hai. Infatti come ho cercato di farti notare se tu piastrassi tutto 1 ml avresti circa 1000 colonie.
Quindi la domanda è:
quanti trasformanti hai nella provetta da 1ml?
Poi se ne piastri 100 vedrai 100 colonie, se ne piastri 50 ne vedrei 50, se ne piastri 325 ne vedrai 325... va bene ma quello che ti interessa è il n° di trasformanti totali, non quelli che hai sulla piastra!

Per dirtelo in un altro modo, è questo che è sbagliato nel tuo calcolo:
100 colonie/ 1x10^6 trasformanti/microgrammi di DNA =
Usa il n° di trasformanti totali!

Oppure se vuoi risolverlo in un altro modo mettendo il "numero di colonie" che hai sulla piastra poi DEVI moltiplicarlo per il fattore di diluizione, dato che hai piastrato solo 1/10 del volume totale.
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laroc
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Inserito il - 27 gennaio 2014 : 18:53:40  Mostra Profilo Invia a laroc un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No, mi dispiace non riesco a capire!
Per quanto concerne i calcoli, lasciando 100 (numero di colonie) il fattore di diluizione con il quale devo moltiplicarlo è 1000. Però poi devo dividerlo per 1x10^6 e basta, o per 1x10^6 x 0,1?
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laroc
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Inserito il - 31 gennaio 2014 : 09:12:18  Mostra Profilo Invia a laroc un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho chiesto direttamente al docente. il risultato dell'esercizio deve venire 1 ng!
Per quanto riguarda il metodo per risolverlo, basta una semplice proporzione matematica: 1x10^6:1 ug = 1x10^3: X da cui, X= 0,001 ug = 1 ng

Ad ogni modo, ha detto che anche come lo avevo risolto in una delle risposte precedenti, va bene ugualmente!
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