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lauretta
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9 Messaggi

Inserito il - 05 ottobre 2004 : 11:22:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lauretta Invia a lauretta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,
da mesi ormai provo a subclonare un frammento di circa 10 Kb nel vettore pcDNA3.1 senza successo!L'inserto è clonato nel plasmide pUC18 da cui lo excido mediante digestione con SalI a 37°C per 3h.L'enzima riconosce 3 siti uno a 5' del frammento e due a 3',9bp di distanza uno dall'altro. Il vettore pcDNA3.1 contiene un sito XhoI compatibile con SalI.Dopo digestione purifico il frammento e il vettore mediante trattamento con fosfatasi alcalina (ROCHE) a 37°C per 60 min.Al termine dei 60 min inattivo la fosfatasi aggiungendo
1\10 del volume di EGTA 200mM a 65°C per 20 min e procedo ad un'estrazione fenolo\cloroformio e precipitazione in etanolo. La ligation è fatta overnight a 16°C e vettore:inserto sono nei rapporti 1:3,3:1 e 1:6.Trasformo cellule XL10GOLD e le piastre sono incubate a 37°C overnight o a 30°C per due notti.In entrambi i casi ottengo molte colonie ma nessuna di quelle controllate(40\60) sono cloni positivi:non contengono l'inserto o hanno un inserto di dimensioni ridotte.
Ho provato per mesi e adesso sono DISPERATA!!
Grazie in anticipo per l'aiuto
Laura

gips
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4 Messaggi

Inserito il - 05 ottobre 2004 : 13:02:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di gips Invia a gips un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao lauretta, volevo chiederti se tratti sia l'inserto che il vettore con la fosfatasi. seconda cosa, la purificazione estraendo la banda dal gel di agarosio?

perche' anch'io ho seri problemi con pcDNA3.1(-) ed uso proprio XhoI come enzima di restrizione, solo che io non ottengo trasformanti. anch'io devo subclonare un inserto da circa 6kb in pcDNA3.1(-) con XhoI e NotI.
tagliando solo con XhoI e rilingado nn ottengo trasformanti!

Visto che il tuo subclonaggio nn e' direzionale, hai provato a creare delle estremità blunt? hai provato con rapporti vett:ins 1:1 opp 1:2? hai controllato che la ligasi funzioni? ovvero che tu nn ti stia portando dietro del plasmide nn linearizzato?
se hai dei primer esterni dopo ligazione puoi fare una PCR, e vedere subito se hai o no ligato l'inserto nel plasmide.
famme sape'
ciao
gips
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lauretta
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9 Messaggi

Inserito il - 05 ottobre 2004 : 15:20:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lauretta Invia a lauretta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao gips tratto con la fosfatasi solo il vettore e la purificazione la faccio estraendo da gel di agarosio! ho controllato che la ligasi funzioni e controllo la ligation mediante pcr utilizzando un primer nel vettore ed uno nell'inserto e ottengo la banda corrispondente!
proverò i rapporti che mi hai suggerito!
per quanto riguarda il tuo problema non ho capito se non ottieni trasformanti quando digerisci solo con xhoI o anche quando digerisci con entrambi gli enzimi?
che cellule di E.coli usi? a me hanno consigliato le XL10GOLD fatte apposta per ospitare grossi plasmidi!!
ti farò sapere se ottengo dei risultati
Ciao
Laura
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gips
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4 Messaggi

Inserito il - 05 ottobre 2004 : 17:58:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di gips Invia a gips un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao laura, ma scusa nn ho capito, con la PCR dici che riesci a controllare la presenza dell'inserto, quindi il tuo problema nn e' la ligazione ma la trasformazione. Quando fai il picking dopo la trasformazione prendi le colonie piu piccoline? visto che teoricamente con un inserto cosi' grande dovrebbero metterci un po a crescere. un'altra cosa, nn riesci ad utilizzare un secondo enzima per fare una ligazione direzionale? hai controllato che nn ci siano siti simili tra plasmide e inserto che magari ti danno probl di ricombinazione?
io uso le DH5alpha dell'invitrogen.
il mio probl e' che nn ottengo trasformanti con XhoI dopo purif da gel (linearizzando il plasmide) e nemmeno con XhoI e NotI quando tento di ligare l'inserto. io suppongo d'avere problemi con XhoI. adesso sto per provare con un altro plasmide che presenta XhoI e NotI, per controllare che nn sia il plasmide che ha qualche probl.
P.S. ho sequenziato l'MCS ed e' ok.
ciao
gips
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