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alessandro.gori
Nuovo Arrivato

10 Messaggi

Inserito il - 25 marzo 2014 : 15:22:32

Salve a tutti ho un problema di crescita di cloni. Ho clonato il mio gene in un plasmide commerciale e ho trasformato in JM109(DE3) ho ottenuto pochissimi cloni 7-8 colonie selezionando su Ampicillina 100microgrmmi/ml. Ho verificato la presenza del gene nei cloni tramite pcr e ho provato a farli crescere su LB + ampicillina 100 microgrammi/ml. Con mia sorpresa ho notato che i cloni hanno difficoltà a crescere nelle prime ore dopo l'inoculo del terreno mentre dopo crescita ON si sviluppano bene. Siccome dovrei ottenere delle competenti di questi trasformanti ho difficoltà a ottenere colture di cellule giovani con densità ottica di 0,2-0,3 tali da trattarle con la soluzione di cloruro di Ca e Mg per ottenere a sua volta delle competenti per trasformarle con un altro plasmide. Qualche suggerimento?

EROTAVLAS
Nuovo Arrivato

16 Messaggi

Inserito il - 31 marzo 2014 : 00:42:55

Ciao, credo che la cosa più semplice date le difficoltà che hai ad ottenere delle cellule giovani da ri-rendere competenti sarebbe provare a fare una co-trasformazione con i due plsmidi. In molti casi trasformare con due vettori nello stesso tempo dà risultati migliori.