Forum

Nome Utente:
Password:
Riconoscimi automaticamente
 Tutti i Forum
 Laboratorio
 Biologia Molecolare
 curva standard per real time pcr
 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
I seguenti utenti stanno leggendo questo Forum Qui c'è:

Aggiungi Tag Aggiungi i tag

Quanto è utile/interessante questa discussione:

Autore Discussione  

Caterina86
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 23 aprile 2014 : 16:26:15  Mostra Profilo Invia a Caterina86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, vi contatto perchè ho un grande dubbio riguardo alla costruzione di una retta di taratura in real time pcr.
devo mettere a punto un protocollo per la ricerca e la quantificazione di legionella pneumophila. siccome in questo caso si parla di quantificazione assoluta, ho la necessità di costruire una curva standard che comprenda dna estratto da concentrazioni note di cellule a partire da 10 alla 6 fino a 10 alla 1.
su molti articoli ho visto che per quantificare le unità genomiche di legionella si estrae il dna da una coltura, si legge l'od di tale dna e per avere una stima delle unità genomiche estratte, si divide il valore per 4,3 fg (corrispondente ad 1 unità genomica di legionella pneumophila). il problema è che in laboratorio non ho un nanodrop, ho solo uno spettofotometro con cuvette da 1 ml, e quindi non posso leggere la concentrazione di dna. in alternativa, per contare il numero esatto di cellule dalle quali andrò ad estrarre il dna, posso usare il metodo di semina su piastra delle diluizioni seriali o misurare l'od a 600 nm, ipotizzando che 1 od corrisponde a circa 10 alla 8 cellule (l'ho trovato in un articolo)??

grazie !!!!

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 23 aprile 2014 : 16:38:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Guarda che per leggere la concentrazione del DNA basta un qualunque spettrofotometro, mica per forza il nanodrop!
(anche perchè altrimenti prima del nanodrop nessuno avrebbe quantificato acidi nucleici!)
Ovviamente in una cuvetta da 1ml leggerai una soluzione diluita, la diluizione migliore la devi trovare anche in base alla concentrazione dei tuoi campioni, quindi magari fai delle prove.
Comunque nel caso qua è spiegato tutto: http://www.molecularlab.it/principi/calcoli-laboratorio/letture-spettrofotometro.asp
Poi puoi anche procurarti delle provette per volumi inferiori, ne esistono di fatte apposta di plastica che vanno bene per gli UV.
Torna all'inizio della Pagina

Caterina86
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 23 aprile 2014 : 16:56:07  Mostra Profilo Invia a Caterina86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
e invece per quanto riguarda la quantificazione mediante semina su piastra o misura dell'od 600? sono ugualmente valide?
Torna all'inizio della Pagina

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 23 aprile 2014 : 18:05:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Caterina86

e invece per quanto riguarda la quantificazione mediante semina su piastra o misura dell'od 600? sono ugualmente valide?

Sono sicuramente molto meno valide!
Non so se il valore che hai trovato per 1 OD600, sia un valore specifico per il tuo microorganismo, perchè da un batterio all'altro cambia.
Comunque a parte questo, entrambi i metodi sono una "stima" del numero di cellule e per quanto tu possa fare una determinazione il più accurata possibile, comunque il valore che ottieni e "N. di cellule". Poi però da queste tu estrai il DNA e non è detto che l'efficienza della tua estrazione sia del 100% e ancor peggio, non è detto che sia la stessa ogni volta che ripeti l'esperimento.
Se non hai alternative, puoi anche farlo, ma sicuramente è una misura meno accurata. Io punterei di più sul cercare di determinare la concentrazione di un campione di DNA per fare la curva standard.
Torna all'inizio della Pagina
  Discussione  

Quanto è utile/interessante questa discussione:

 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
Vai a:
MolecularLab.it © 2003-18 MolecularLab.it Torna all'inizio della Pagina