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jazz84
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19 Messaggi

Inserito il - 30 aprile 2014 : 23:01:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jazz84 Invia a jazz84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,
volevo chiedervi aiuto perchè ho un problema con dei WB. Cercherò di spiegarmi nel miglior modo possibile.
Sto lavorando su un pathway di proteine, finchè ho valutato l'espressione (quindi la proteina totale) tutto è andato bene, non appena ho iniziato a lavorare sulla forma fosforilata(come mi aspettavo) la tragedia!!!! Sviluppo in perosiddasi e quello che vedo sono una serie di bande aspecifiche, ma nessuna traccia della mia proteina.
Per una delle tante ho provato a sviluppare in Fosfatasi alcalina e sono riuscita ad ottenere un segnale MINIMO.
Che devo fare?
Ps. ho provato a caricare da 30ug fino ad arrivare a 50ug di proteine!
Per una (p70S6k) ho cambiato anche la conc. dell'Ab(MONOCLONALE) (da 1:1000 a 1:500)
Che devo fare sono disperataaaa!!!
Grazieee confido in voi...

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1700 Messaggi

Inserito il - 01 maggio 2014 : 01:16:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Usi latte o BSA per blocking/Ab? Moltissimi anticorpi che vedono P-proteine funzionano in BSA.
Fai il rosso ponceau prima del primario? il rosso ponceau defosforila le proteine...

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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jazz84
Nuovo Arrivato



19 Messaggi

Inserito il - 01 maggio 2014 : 04:56:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jazz84 Invia a jazz84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazieeee!!!!
Si uso BSA al 3% infatti!!!!! ma la storia del ponceu mi mancava...lo uso per tagliare le membrane ma con questa dritta penso che domani ne farò a meno e ti farò sapere :)
GRAZIE mille!!!!

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jazz84
Nuovo Arrivato



19 Messaggi

Inserito il - 02 maggio 2014 : 22:50:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jazz84 Invia a jazz84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti di nuovo,
volevo aggiornarvi sul mio WB e chiedere ancora il vostro aiuto..ho provato a non utilizzare il Ponceu ma nessuna differenza!!! tra l'altro sullo stesso blot di pAKT ho provato a vedere ERK1/2 e mi è uscita una doppia banda da paura (bellissima)!!!
Quindi il mio problema penso sia la fosforilazione se qualcuno ha esperienza con le proteine fosforilate può darmi una mano????
Pleaseeeeeee

Buon weekend a tutti :)
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Vanescience
Nuovo Arrivato




1 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2014 : 16:34:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Vanescience Invia a Vanescience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da domi84


Fai il rosso ponceau prima del primario? il rosso ponceau defosforila le proteine...



Ciao scusami, potresti spiegarmi perchè il rosso ponceau defosforila le proteine? Perchè mi servirebbe usarlo prima di fare un immunoblotting su una proteina fosforilata. Grazie!
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Pirof
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 22 novembre 2018 : 12:40:40  Mostra Profilo Invia a Pirof un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti, ho bisogno di aiuto per comprendere cosa sta succedendo ai miei western blot...
Tutto scorre perfettamente fino all'arrivo in camera oscura, faccio il primo sviluppo con ECL della Thermo e ho un segnale debole ma comunque visibile delle bande attese, con il mio tutor decidiamo di alzare il segnale utilizzando l'incubazione con l'ECL "turbo" della GE healthcare.
Il risultato ottenuto è che uno dei due filtri mi ha dato le stesse bande ottenute con il primo ECL mentre nel secondo filtro sono sparite le bande.
Ho esposto una seconda lastra per più tempo e anche quella che mi era venuta prima mi ha dato lastra totalmente limpida, ho pensato di aver consumato la perossidasi dell'anticorpo secondario, per scrupolo ho lavato i filtri in TBS-T e ho incubato di nuovo con il "Turbo", risultato è che su una sola delle due lastre mi è comparsa solo una banda....che fine hanno fatto tutte le altre???

mi aiutate a capire??? grazie a tutti di cuore <3
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