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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
 Inserito il - 09 maggio 2014 : 18:16:37
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Ciao ragazzi!
Chiedo qui se qualcuno che abbia usato abitualmente il FACS potesse aiutarmi a settare i parametri l'acquisizione dei dati e nell'analisi e rappresentazione dei risultati. Sì sono domande generiche, specificherò una volta che avrò qualcuno con cui parlare 
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Miki_
Nuovo Arrivato
29 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2014 : 22:55:40
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| io posso provarci se vuoi, ma credo che decidere i parametri di acquisizione a distanza potrebbe essere problematico (se parliamo dei voltaggi...sui canali no problem) |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 11 maggio 2014 : 13:23:49
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Essendo la prima volta che lo uso (ed avendo poca esperienza anche coloro che dovrebbero seguirmi) pur conoscendo il principio che sta dietro all'analisi ho ancora difficoltà a capire che canali dover guardare e soprattutto come impostare l'analisi dei dati ottenuti.
Intanto ti dico subito che quello che interessa a me è poter vedere delle differenze nella distribuzione delle mie cellule nelle diverse fasi del ciclo cellulare. La marcatura è stata quindi fatta semplicemente con ioduro di propidio (PI) per quantificare il contenuto in DNA.
Per questo tipo di analisi sicuramente è necessario fare riferimento agli istogrammi con intensità di fluorescenza in ascisse. Intanto che canale è bene osservare?
Come software usiamo CellQuest. Avrei tantissime domande ma intanto vediamo che mi dici. :) |
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Caffey
Utente Attivo
Città: Perugia
1496 Messaggi |
Inserito il - 11 maggio 2014 : 14:38:12
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Ciao. Provo anche io a dirti quel poco che so, magari ti fa comodo.
PI emette sia in FL-2 che in FL-3, quindi il settaggio dello strumento è fondamentale perché ti permette di correggere questa sovrapposizione, ma non l'ho ancora mai fatto praticamente quindi non so aiutarti.
Per quanto riguarda l'analisi tutto dipende da quello che vuoi fare e da che tipo di cellule stai studiando, per cui c'è bisogno di qualche dettaglio in più. |
[...] Hunc igitur terrorem animi tenebrasque necessest
non radii solis neque lucida tela diei
discutiant, sed naturae species ratioque. [...]
Titus Lucretius Carus |
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Miki_
Nuovo Arrivato
29 Messaggi |
Inserito il - 12 maggio 2014 : 12:36:12
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non ho mai usato CellQuest, quindi ti dico le cose in modo molto generale
dunque...intanto il protocollo di marcatura: devi ottimizzare la quantità di permeabilizzante (io uso l'Np40, ma puoi usare anche il tween) e di RNAsi, variano anche di parecchio a seconda del tipo cellulare (ad esempio per mia esperienza serve più np40 per cellule che crescono adese che per cell in sospensione). la marcatura viene meglio se fatta 4°C on che a 37°C per 2h. cmq se ti serve un protocollo base posso girarti il mio, è per linfociti ma si può adattare.
per l'acquisizione: FL2 o FL3 a seconda del tipo cellulare (da quanto ho visto ci sono casi in cui il segnale risulta più o meno pulito in un canale piuttosto che in un altro, probabilmente è per via dell'autofluorescenza diversa delle cellule).
per cellule diploidi (alcune linee tumorali sono anche 4n) devi muovere il voltaggio in modo da avere il picco della G0/G1 sulla seconda tacca dell'asse x (quella che di solito corrisponde al 100.000). attenzione alla scala che deve essere logaritmica in modo da farti vedere le differenze più fini.
dall'analisi devi ovviamente escludere i detriti e le cell in apoptosi (la famosa fase sub-G0 che molti considerano poco affidabile-non informativa) e soprattutto i doppietti. per togliere i doppietti devi fare un dot plot ponendo sull'x FSC-A (area) e sull'y FSC-H (altezza). così facendo gli eventi si disporranno su una diagonale: fai un gate il più possibile stretto in modo da selezionare solo gli eventi nella diagonale, quelli esterni sono i doppietti che non devi considerare.
una volta ottenuto il tuo istogramma per l'analisi fai attenzione che il totale degli eventi che tu metti in G0/1-S-G2/M sia 100 (purtroppo le fasi vanno selezionate a occhio a seconda dei 3 picchi... con la G0/1 è facile, sulla S-G2/M dipende da quanto ti viene pulito il ciclo)
per ora non mi sovviene altro...se hai dubbi chiedi pure :)
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 13 maggio 2014 : 00:12:35
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Le informazione sono molto utili :)
Intanto la permeabilizzazione l'ho fatta usando NP40 per 30 minuti e a temperatura ambiente con PI, molto diverso come tempistiche da quello che usi tu. Comunque credo che sia venuta piuttosto bene, vedo in modo molto distinto i classici picchi nell'istogramma. Non penso sia quello il problema.
Ti dico come ho impostato io l'analisi, sulla base di quello che ho trovato anche online. L'acquisizione l'ho fatta su un totale di 10000 eventi (counter) e purtroppo/per fortuna avevo già un file di impostazioni per lo strumento settate per il mio tipo cellulare. Ho notato però che i miei picchi cadono in modo leggermente sfalsato rispetto ai riferimenti sull'asse (picco G1/G0 poco sotto 200 e picco G2/M poco sotto 400). Per correggere il settaggio operativamente come si fa?
La scala che ho usato non è logaritmica.
Per escludere i debris e gli aggregati ho creato un dot-plot con FL2-W sulle ascisse e FL2-A sulle ordinate. In questo modo ottengo comunque una diagonale di cellule che sono di mio interesse e ho impostato un gate per questa regione da considerare nell'analisi.
Una prima domanda è se fosse stato meglio impostare questo gate per l'acquisizione dei dati, quindi ancor prima di iniziare ad acquisire, in modo da avere il 100% dei 10000 eventi inclusi nell'area del gate.
E poi come posso far si che gli eventi inclusi nel gate siano 100? Intendi metterli in percentuale ripetto agli eventi nel gate? In quel caso l'ho fatto :)
E appunto volevo chiederti se ci fosse un modo per settare in automatico le regioni da associare alle varie fasi in base alla posizione del picco ma non è così :( |
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Miki_
Nuovo Arrivato
29 Messaggi |
Inserito il - 13 maggio 2014 : 12:47:17
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per "spostare" i picchi ti basta variare il voltaggio. però non saprei dirti, magari con la tua scala è giusto che se ne stia sui 200 (per capirci, di solito è la seconda tacca che trovi sull'x).
sorry, scala lineare, ho scritto io un'ostiata...si vede che è da un po' che grazie ad dio non faccio più cicli xD(la log era come ce l'aveva impostata la tecnica della coulter, ma alla fine ce l'eravamo cambiata perchè faceva strane cose)
sì, con 100 intendevo la %, mi sono espressa male :p
sul gate...mha..a meno che tu non abbia una quantità esagerata di doppietti la roba che escludi non dovrebbe essere molta, se anche acquisisci 10.000eventi e poi di fatto ne analizzi 8.000 non penso sia un problema...poi se da come dici i picchi sono belli direi che ci siamo (se hai pochi eventi lo vedi che i picchi son brutti e vuoti..almeno, col mio programma di analisi schifoso lo vedi).
no..le regioni sono tristemente da mettere "a occhio", sapevo di un tizio a roma che stava progettando un mega-programmone che paragonava il tuo ciclo con altri millemila per stimare una divisioni in fasi, ma visto che non è mai saltato fuori comincio a credere che sia una leggenda metropolitana :D |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 13 maggio 2014 : 19:13:14
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| Di aggregati e doppietti ne ho abbastanza, prendono quasi metà degli eventi registrati, ma guardando anche plot in giro per il web ne ho visti di simili ai miei, dovrebbero essere un problema relativo. Comunque lavoro su cellule umane HCT. Ho capito, quindi in fondo l'analisi non l'ho impostata malaccio :) Grazie mille per i consigli! |
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