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gtca
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
 Inserito il - 22 giugno 2014 : 17:20:32
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Cosa mi sapete dire della PCR hot start con anti-taq?
E sapete dirmi quanto tempo ci vuole perchè 25, 30 cicli di PCR siano portati a termine?
E nemmeno la NESTED PCR mi è troppo chiara.
Nellla PCR normale, devo mettere una quantità di PRIMER tale che a ogni amplificazione ce ne siano due pronti ad attaccarsi ai nuovi filamenti, mentre nella PCR NESTED i primo doppio filamento amplificato, all'interno dell'amplificato possiede già un'altra copia di PRIMER che permette la seconda amplificazione e via così?
Quindi nella NESTED serve una quantità di primer minore poichè si amplificano da sola?
No? Sì? Mh.
Grazie
  
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
 Inserito il - 23 giugno 2014 : 14:11:03
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1) La pcr hot start è un kit composto da un anticorpo che impedisce all'enzima di funzionare a temperature basse. Quando la temperatura è elevata l'anticorpo si libera dall'enzima e le permette di funzionare. Tutto questo serve per evitare che l'enzima funzioni a temperature basse formando amplificati aspecifici, soprattutto nei primissimi cicli.
2) la durata della pcr è variabile in funzione del protocollo di ogni ciclo, quindi è variabile. Generalmente si può arrivare dai 60 secondi a ciclo fino a 15 minuti a ciclo... Quindi estremamente variabile. In media circa 1,5-3 minuti a ciclo.
3) Nested = Fai una pcr su un prodotto di una pcr. Ovvero, Fai una PCR su un DNA con primers A e B ottenendo un prodotto di PCR. Su questo prodotto di PCR fai una nuova reazione di PCR con altri due primers C e D più interni. Si usa per verificare la specificità, per aumentare il prodotto di PCR nelle reazioni difficili, a volte per inserire siti di restrizione in un prodotto di pcr. La tecnica ha il notevole svantaggio di avere un'alta frequenza di inserire degli errori nel prodotto finale.
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