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gtca
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15 Messaggi

Inserito il - 22 giugno 2014 : 22:46:16  Mostra Profilo Invia a gtca un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, ho dei dubbi:

1) amplifico un inserto tramite PCR. Dunque prendo il gene che voglio amplificare e aggiungendo taq polimerasi etc. etc. amplifico la sequenza.
2) Ottengo il gene amplificato, ma poi mi dicono che devo 'ritagliare' questo gene con degli enzimi di restrizione, infatti è bene che preparando la PCR io faccia si che di siano dei siti di restrizione vicino al gene da amplificare. Ma non farei prima ad amplificare SOLO il gene che mi interessa così da non dover poi RITAGLIARE nulla?? (domanda 1)

2) tagliato l'inserto lo inserisco in un vettore da inserire poi in un batterio, ad esempio. In questo modo ottengo diverse copie dell'espressione del gene in questione, quindi diverse proteine. E' questo che si intende per SUBCLONAGGIO? (domanda 2)

GRAZIE

Ho l'esame tra poco. Lo so che sto intasando il forum, ma qua nessuno risponde!

Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 23 giugno 2014 : 14:19:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
domanda 1:
sarebbe ideale ma ovviamente tecnicamente più difficile.
hai la necessità di amplificare quello che desideri e purificarlo da tutto il resto, quindi hai bisogno di una PCR
vuoi inserirlo in un vettore (clonaggio) e quindi ti servono i siti di restrizione per ligarlo, quindi hai bisogno di siti di restrizione e di tagliare il DNA.

Se tagli il DNA otterrai una miriadi di frammenti che dovresti selezionare (come?) ed ottenere in quantità adeguate (PCR?)
se amplifichi solo il DNA come lo inserisci nel vettore per fare il clonaggio?

domanda 2:
esistono varie interpretazioni di clonaggio e subclonaggio.
quella che credo sia più corretta è questa
Tecnicamente il clonaggio è la tecnica che ti permette di ottenere più copie di un DNA, quindi inserimento in un vettore, batterio, etc etc.
subclonaggio si intende la tecnica che ti permette di ottenere più copie di un tratto di DNA più piccolo, quindi tagli un vettore e ne amplifichi solo una parte in un altro vettore.

Alcune persone usano i termini in maniera indistinta, mentre altri fanno riferimento al clonaggio quando si parte da un NON vettore a DNA, mentre subclonaggio quando si parte da un vettore a DNA.


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